基于DArTseq的SNP標記的西瓜核心 種質遺傳多樣性和群體結構分析

羊杏平 任潤生 徐錦華 李蘋芳 張曼 劉 廣 姚協豐

目的與意義： 親本材料是進行育種工作的基礎，遺傳基礎狹窄導致難以培育出突破性品種，因此亟需加強遺傳資源的引進及其農藝性狀特征和遺傳基礎的了解與掌握，對現有優良西瓜品種和育種親本材料進行遺傳多樣性研究，可有效減少相似遺傳背景的組合，減少育種的工作量。同時，隨著分子生物學技術的發展，分子標記種類及檢測手段日趨完善，利用分子標記技術對植物進行聚類分析，可以快速了解植物的遺傳多樣性、親緣關系和品種鑒定等。本研究對37份核心西瓜種質進行遺傳多樣性分析，確定這些西瓜核心種質材料間的遺傳背景差異，為后期育種工作中的親本組配、等位基因發掘和標記輔助選擇等提供參考。

材料與方法： （1）所用的西瓜核心種質材料共37份，主要包括優良國內西瓜品種和國外引進品種、高代育種自交系、以及野生西瓜種質材料。這些材料由于來源不同，存在一定的遺傳差異，各種表型性狀差異明顯。（2）溫室內取幼嫩葉片，抽真空干燥保存，采用CTAB法提取基因組DNA，用紫外分光光度計法檢測其質量和濃度，稀釋至50～100 ng·μL-1，-20 ℃保存備用。（3）采用DArT標記結合第二代短序列測序技術獲得相應材料的SNP基因型。（4）利用軟件PowerMarker Version 3.25計算主基于位點頻率（major allele frequency），基因多樣性（gene diversity），多態性信息含量（polymorphic information content）等。利用軟件Darwin Version 5.0，采用基于遺傳相似系數（genetic similarity，GS），并以非加權數據分析法（Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Average，UPGMA）進行聚類，構建聚類樹狀圖。軟件Darwin Version 5.0也用來進行主成分分析。（5）以Structure v2.3軟件進行群體遺傳結構的分析，該方法利用每個個體多位點基因型數據（multilocus genotype）的差異進行聚類，對個體的來源進行推斷，并估計最佳群體組群數K，其取值范圍為1～8，將馬爾可夫鏈（Markov Chain Monie Carlo，MCMC）開始時的不作數迭代（length of burn-in period）設為 10 000次，再將不作數迭代后的MCMC設為10 000次，迭代次數（number of iterations）設置為8。

結果與分析： （1）本實驗采用DArT標記結合第二代測序方法對37份西瓜核心種質進行基因型分析，對測序數據結果采用重復率為99.7%和call rate 為98.8%的標準，共獲得了4 808個在37個西瓜核心種質間具有多態性的SNP標記。為了使后續分析結果更加可靠，對4 808個SNP標記在37個西瓜核心種質中的缺失率大于5%的標記剔除，最后共獲得了3 882個SNP標記用于后續進一步的分析。同時以西瓜品種‘97103的基因組序列為參考基因組序列對每一個SNP在染色體上的物理位置進行了確定（最小堿基相似度為大于90%，E值為小于10-5），平均每條染色體上含有352個SNP標記。②根據對37份西瓜核心種質SNP基因型分析，基因多態性（gene diversity）的范圍為0.03～0.5;標記的多態性信息含量（PIC ：polymorphism information content）值為0.02～0.38。平均基因多態性和PIC值分別為0.14和0.13。對兩者值的分析，共有91%的基因多態性值和93%的多態性信息含量（PIC）值位于0.05～0.20之間。（3）根據3 882個SNP標記計算得到遺傳相似系數，按Neighbor-joining （N-J）法構建了37份西瓜核心種質材料之間的遺傳關系聚類圖，其中2個西瓜野生種質明顯地和其他35分西瓜栽培種分開。為了使聚類圖顯示的效果更加清晰，進一步對35個栽培西瓜種質又進行了聚類分析，結果顯示35個栽培西瓜種質可以被區分為3類。第一類包括了11份材料：Au-RS，Au-GSC，All Sweet，Smokylee，Charleston Gray，Sugarlee，LW023，SSD，Crimson Sweet，9 Jiu， LW022。第二類包含了20份材料：Calhoun Gray，P4，P1-3，P3-1，Sugar baby，Hong 5-2，SW055-1，MW097，MW099，K3，Fuxing F8，MW095，MW096，SW057，Red Flesh 8424，Furong F8，MW026，MW089，J2，MW022，其中2份來自美國，1份來自中國臺灣，剩余為來自中國大陸。第三類包含4份材料，R-1-3，R-1-2，R-2-1-2，SW043，其中3份為江蘇省選育的育種系，1份來自中國臺灣的育種系。（4）為了更加直觀地觀察到各個西瓜種質材料之間的關系，我們根據遺傳相似系數進行了主成分分析。結果顯示37個西瓜核心種質也是被明顯地分為2大類，即野生西瓜類和栽培西瓜類。同樣，和聚類結果一樣的是，剩下的35份西瓜栽培品種也主要分為3類，第一主成分和第二主成分分別介紹變異的25.9%和11.2%。（5）同樣用3 882個SNP標記分別對37份和35份西瓜種質進行了群體遺傳結構分析。對37份西瓜種質來說，LnP（D）和ΔK的峰值都出現在當K值等于2時，說明這37份西瓜種質也主要劃分為野生類和栽培類2個大類。當對35個西瓜種質材料進行群體遺傳結構分析時，LnP（D）值隨著K值從1到8連續遞增時，LnP（D）值的拐點出現在當K值從2到3時。同樣ΔK值的峰值出現在當K值等于3的時候。這些結果說明35份西瓜種質主要被分為3個類群，結果和聚類分析和主成分分析的結果完全一致。

結? ? ?論： 為了將一些核心西瓜種質材料有效地在西瓜育種中加以利用，本研究利用3 882個SNP標記，對37個西瓜核心種質進行了遺傳多樣性分析，結果顯示2個野生西瓜種明顯區別于西瓜栽培種，而剩下的35個西瓜栽培種則主要劃分為3個主要的類群。