形態觀察、RNA-Seq定量和表達譜分析： 南瓜砧木嫁接西瓜類胡蘿卜素生物合成的新見解

劉 廣 羊杏平 徐錦華 張曼 侯茜 朱凌麗 黃瑩 熊愛生

目的與意義： 西瓜（Citrullus lanatus）屬于葫蘆科家族的一員，是一種重要的園藝作物，以其營養多汁的果肉聞名全世界。西瓜種植效益較高，但受枯萎病的影響，不能在同一園區實現連年栽培。嫁接技術的應用有效地解決了西瓜不能連作的難題。為了充分發掘果實發育期南瓜砧木對嫁接西瓜基因表達的影響及鑒定參與嫁接西瓜番茄紅素生物合成的基因，本研究以自根西瓜、自根嫁接西瓜、南瓜嫁接西瓜果實四個發育時期的瓜瓤組織為試驗材料，利用HPLC測定番茄紅素的含量，并用RNA-Seq（quantification）技術及qRT-PCR進行了基因組范圍內轉錄本的研究。

材料與方法：（1）采用RNAiso Plus（Takara，大連，中國）的試劑盒進行果肉組織樣本總RNA的提取。（2）使用RNA Pico芯片的安捷倫2100生物分析儀（美國）進行RNA濃度和質量的評估。（3）構建RNA-Seq文庫，通過Illumina公司HiSeq 2000測序平臺進行測序。（4）對這些文庫進行了RNA-Seq量化測序。使用SOAPaligner / SOAP2軟件（Li et al. 2009）對葫蘆科網站上已發表的西瓜參考基因序列進行比對。（5）使用NOIseq方法確定每個基因差異表達統計的顯著性（Sonia et al. 2011）。（6）使用高效液相色譜儀器分析番茄紅素，在472 nm UV-V光譜檢測。（7）選擇了8個與番茄紅素生物合成相關的差異表達基因進行qRT-PCR。實時PCR反應條件是：95 ℃ 3 min，其次是95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，40個循環。然后在60 ℃進行溶解曲線分析。

結果與分析： ①對自根西瓜（NGW）、自根嫁接西瓜（SGW）及南瓜嫁接西瓜（PGW）在果實發育時期的果實變化進行了研究。結果表明，在果形指數上，NGW、SGW、PGW之間各個時期差異不大，在成熟期時三者的果形指數均為1。在果實可溶性固形物含量方面，成熟時三者的中心可溶性固形物為13%左右，邊緣可溶性固形物約為9.8%，表明嫁接對果實的可溶性固形物含量無顯著影響。在單果質量方面，NGW、SGW、PGW 4個時期差異不大，成熟期時三者約為5kg，南瓜砧木未顯著降低嫁接西瓜的單果質量。在果肉硬度方面，除26DAP，其余時期PGW與NGW、SGW無顯著差異，南瓜砧木對嫁接西瓜果實的硬度無顯著影響。（2）采用高效液相色譜法測定NGW、SGW和PGW西瓜果實在四個不同發育階段番茄紅素的含量。研究結果顯示，嫁接西瓜中β-胡蘿卜素含量極低，在果肉中番茄紅素占主導地位。在NGW和SGW中，果實中果肉番茄紅素的含量在整個果實發育成熟期明顯增加，番茄紅素含量最高為約35 μg·g-1 FW。然而，在PGW中，果實番茄紅素含量在4個發育時期呈先增加后下降的趨勢，在26 DAP時，它達到了峰值，為27 μg·g-1 FW，然后略有下降，直到成熟期34 DAP時，為24 μg·g-1 FW。（3）在這項研究中，我們對編碼番茄紅素合成途徑的關鍵酶基因進行了分析。共有來自于8個與番茄紅素相關的基因家族的33個基因在果肉著色和植物營養價值中發揮巨大作用。筆者對這33個基因在果實發育成熟的四個時期的基因表達情況進行了追蹤。（4）在西瓜測序結果中，發現與GGPS、CRTISO和CHYe酶合成相關的基因都只有1個，分別為WMU29546、WMU64670和WMU14036。2個基因WMU38667和WMU69109參與調控PSY酶，WMU41454和WMU66972參與調控ZDS酶，基因WMU41454和WMU66972參與調控LCYb。有3個基因WMU32086、WMU04959和WMU08893參與調控PDS合成。共有21個基因參與調控CRTISO。然后根據他們的表達模式，筆者進一步將這33個番茄紅素生物合成相關的差異表達基因分為4類：第一類為在果實發育四個時期都高度表達的差異基因;第二類為在果實發育后3個時期（18DAP，26DAP和34DAP）基因表達水平較高;第三類為在果實發育后兩個時期（26DAP和34DAP）基因表達水平較高;第四類為在果實發育四個時期都低度表達的差異基因。在NGW、SGW和PGW中，有28個基因表達一致。有5個基因在NGW、SGW和PGW果實發育期表現不一致，基因WMU69109在NGW和PGW歸為第二類，而在SGW表現為第一類;基因WMU22455在NGW和SGW中歸為第二類，而在PGW表現為第一類;基因WMU23214 、WMU71326和WMU30436在NGW和SGW歸為第三類，而在PGW表現為第二類。此外，PGW中發現有9個基因在果實發育期的變化趨勢與兩對照不一致，包括WMU66972、WMU79499、WMU71326、WMU42266、WMU64670、WMU36962、WMU71302、WMU75287和WMU14036基因。（5）結果顯示，挑選的8個基因在數字表達分析和qRT-PCR分析2種方法上雖然在不同時期的表達上數據存在一些差異，但是這些基因在果實發育時期的基因表達變化上趨勢大概一致。RNA-Seq和qRT-PCR在基因表達水平上具有很高的相關性（r2 = 0.61～0.97）。

結? ? 論： 轉錄組分析數據提供了果實發育期間嫁接誘導基因調控番茄紅素生物合成新的信息。8個基因家族（GGPS、PSY、PDS、ZDS、CRTISO、LCYb、LCYe和CHY）中33個基因的表達水平與番茄紅素的生物合成有關。南瓜嫁接西瓜果實發育過程中有14個基因差異表達，這表明這些基因可能有助于調控嫁接西瓜果實中番茄紅素的生物合成。