水蜜桃E3 泛素連接酶PpARI1 基因的克隆及表達載體構建

苑 婕, 馬方瑋, 李夢云, 曹 慶, 鄭偉尉, 萬嗣寶

(1. 上海大學生命科學學院上海市能源作物育種及應用重點實驗室, 上海200444;2. 浙江農業大學農業與食品科學學院浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室, 杭州311300)

泛素/26S 蛋白酶體系統在真核生物中能夠修飾蛋白, 從而使蛋白質有選擇性地降解[1-2].作為一種強有力的監管調控機制, 泛素/26S 蛋白酶體系統參與細胞周期調控、轉錄、信號傳導、生長與凋亡、生物與非生物脅迫等幾乎每一個重要的生命過程[3-5]. 有研究指出, 擬南芥中泛素/26S 蛋白酶體系統涉及到的蛋白超過擬南芥總蛋白的6%[6]. 泛素化是該系統發揮作用所必需的. 這個過程需要3 種酶, 分別是泛素激活酶(ubqiuitin-activating enzyme, 簡稱El)、泛素結合酶(ubiquitin-conjugating enzyme, 簡稱E2)、泛素連接酶(ubiquitin ligase, 簡稱E3)[7].泛素首先被E1 催化, 形成高能硫酯鍵; 然后被激活的泛素轉移到E2 上; 最后通過E3, 在泛素的末端和靶蛋白的賴氨酸殘基上形成異肽鍵[8]. 通過這3 種酶, 將單一或多個泛素偶聯到靶蛋白上, 由26S 蛋白酶體復合物將被識別的靶蛋白降解[9].

E3 泛素連接酶是泛素/26S 蛋白酶體系統中最重要的一類酶, 雖然發現最晚, 但種類多樣且功能最為復雜[10-11], 其中識別被泛素化的靶蛋白是其最主要的功能. 由于底物的特異性由E3 決定, 所以E3 在整個蛋白質的降解過程中發揮著至關重要的作用[12-13]. 研究表明, E3 泛素連接酶在動植物中可調控多個生理代謝途徑. Silvia等[14]研究發現, E3 泛素連接酶PJA1 基因通過對EZH2 蛋白的降解促進細胞分化, 從而促進骨骼肌細胞的生成. Liu等[15]發現, E3 泛素連接酶smurf1 與smurf2 基因能促進成骨細胞分化, 有利于骨折愈合. Wei等[16]研究表明, E3 泛素連接酶YopM 通過作用于NLRP3 蛋白而使病變細胞死亡.Dong等[17]研究表明, E3 泛素連接酶PRT1 基因通過作用于泛素化的DA1 蛋白酶而限制了細胞的無限增殖. E3 泛素連接酶在植物響應脅迫信號的應答過程中也發揮了重要作用. 干旱脅迫處理轉紫萼蘚DSR7 基因的擬南芥植株, 發現植株的含水率及成活率均高于野生型, 說明該基因能增強植物的抗干旱能力[18]. 在擬南芥中轉入棉花SARP1 基因, 在鹽脅迫條件下, 發現轉基因植株的發芽率低于野生型, 說明該基因負調控植物耐鹽性[19]. 在冷害脅迫下, 水稻中的E3 泛素連接酶HOS1 基因的表達量增加[20-21], 說明該基因能提高植物的抗寒性.

本研究以“久保”水蜜桃為實驗材料, 利用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)克隆出水蜜桃E3 泛素連接酶PpARI1 基因序列, 并進行生物信息學分析, 同時成功構建了表達載體pCAMBIAy1300-PpARI1, 為后續的遺傳轉化實驗和該基因的功能分析奠定了基礎.

1 實驗材料

1.1 實驗材料

以上海市浦東新區生產的“久保”水蜜桃(Prunuspersica L. cv. Jiubao)果實為實驗材料,取樣后立即送回實驗室處理.

1.2 菌株、載體和試劑

pGM-T 載體、DNA Marker Ⅲ、大腸桿菌TOP10 感受態細胞、6×DNA Loading Buffer、質粒小提試劑盒、T4 DNA 連接酶, 購自北京天根生化科技有限公司. 表達載體pCAMBIAy 1300 和農桿菌感受態細胞, 由本實驗室提供. Reverse Transcription System(Cat.#A3500)試劑盒, 購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司. 柱式植物RNAout 2.0 試劑盒、即用型高保真PCR 試劑盒, 購自北京天恩澤基因科技有限公司. Taq DNA 聚合酶, 限制性核酸內切酶Xba Ⅰ與BamH Ⅰ, 購自寶生物工程(大連)有限公司. 柱式DNA 膠回收試劑盒、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、慶大霉素(Gen), 購自生工生物工程(上海)股份有限公司, 引物也由該公司合成. 其他常規生化試劑均為國產分析純.

2 實驗方法

2.1 PpARI1 基因的克隆

2.1.1 水蜜桃果實總RNA 的提取與PpARI1 基因的擴增

按照柱式植物RNAout 2.0 試劑盒說明書的操作步驟提取水蜜桃果實的總RNA. 參照Reverse Transcription System(Cat.#A3500)試劑盒說明書的操作步驟合成cDNA. 以大豆ARI1 核酸序列(NM 001289243)為探針,在NCBI 網站對桃的核酸數據庫進行在線BLAST,搜索到與之同源性為80%的一條具有完整開放閱讀框(open reading frame, ORF)的核苷酸序列(XM 007221935). 根據此序列, 用Primier 5.0 軟件設計特異性引物, 上游引物為5’-ATGGACTCCGAGGACGATA-3’,下游引物為5’-TCACCGTCGCTGGTGGTGGCACATG-3’. 以水蜜桃果實cDNA 為模板, 進行PCR 擴增. 反應體系如下: 高保真PCR Mix 15 μL,cDNA 2 μL, 上下游引物各1 μL, 加雙蒸水至30 μL. 反應程序如下: 94?C 預變性5 min;94?C 變性30 s, 50?C 退火40 s, 72?C 延伸2 min, 35 個循環; 72?C 再延伸10 min, 4?C 終止反應. 取PCR 產物44 μL, 加入4 μL dNTP 和2 μL Taq DNA 聚合酶, 72?C 孵育45 min, 進行加A 處理.

2.1.2 PCR 擴增產物的回收純化及測序

PCR 產物經1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后切下目的條帶, 用膠回收試劑盒對其進行純化回收, 將回收產物與pGM-T 載體連接. 將連接產物轉化大腸桿菌TOP10 感受態細胞, 在含Amp(50 μg/mL)和X-Gal, IPTG 的LB 瓊脂平板培養基上進行藍白斑篩選. 培養12 h 后挑選白色單菌落搖菌. 經PCR 驗證后, 選取陽性結果菌液保存, 并送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序.

2.1.3 PpARI1 基因的序列分析

在GDR 網站(http://www.rosaceae.org/gb/gbrowse/prunus_ persica/)對PpARI1 基因進行染色體定位分析. 進入GSDS 網站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php), 在CDS Sequences 欄輸入鑒定出的PpARI1 基因的編碼區序列, 在Genomic sequences 欄輸入該基因全長序列, 點擊左下方處Submit 按鈕, 分析PpARI1 序列的外顯子和內含子結構. 用EXPASy 網站的ProtParam 在線程序(http://web.expasy.org/protparam/)分析PpARI1 蛋白的分子量、理論等電點以及疏水性情況.

2.2 表達載體的構建

2.2.1 以兩端添加Xba Ⅰ與BamH Ⅰ酶切位點的新引物克隆PpARI1 基因

以測序正確的菌液為材料, 重新設計兩端添加Xba Ⅰ與BamH Ⅰ酶切位點的引物進行PCR 擴增. 上游引物為5’-GCTCTAGAATGGACTCCGAGGACGATA-3’; 下游引物為5’-CGGGATCC TCACCGTCGCTGGTGGTGGCACATG-3’. 反應體系與程序同2.1.1 節, 回收PCR 產物與pGM-T 載體連接之后, 轉化大腸桿菌TOP10 感受態細胞并進行測序.

2.2.2 構建植物高效表達載體

取測序成功后的菌液,用試劑盒提取質粒. 使用Xba Ⅰ與BamH Ⅰ對pGM-T-PpARI1 重組質粒和真核表達載體pCAMBIAy1300 進行雙酶切. 回收目的基因片段和真核表達載體片段之后, 用T4 DNA 連接酶16?C 連接過夜. 將連接產物轉化大腸桿菌TOP10 感受態細胞,涂布于含Kan(50 μg/mL)的LB 平板上. 培養12 h 后挑選白色單菌落, 搖菌并提取質粒,經PCR 檢測和酶切驗證正確后測序.

2.2.3 表達載體轉化農桿菌

取含有重組表達載體的質粒5 μL, 加入到處于冰水混合狀態的農桿菌中, 用熱激法轉化后加入800 μL LB 液體培養基, 于28?C 振蕩培養3～4 h. 8 000 r/min 離心后, 留取少量上清液輕輕吹打. 重懸菌塊涂布于含50 μg/mL Kan, 50 μg/mL Rif 和50 μg/mL Gen 的YEP 培養基上, 于28?C 倒置培養2 d. 待平板上長出白色單菌落后, 挑菌培養, 提取重組質粒進行PCR驗證.

3 結果與分析

3.1 PpARI1 基因的PCR 擴增

以水蜜桃總RNA 反轉錄成的cDNA 為模板, 利用桃ARI1 基因特異性引物進行PCR 擴增.經1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,擴增產物長度在1 800 bp 左右,與預期的目的基因大小一致,如圖1 所示, 其中M 為DNA Marker Ⅲ, 1～3 為擴增產物. 將該片段回收, 與pGM-T 載體連接后轉化大腸桿菌TOP10 感受態細胞, 篩選陽性克隆, 進行測序, 得到一條長度為1 764 bp 的基因序列, 命名為PpARI1. 該序列已提交到GenBank, 登錄號為KY887584.

圖1 目的基因的PCR 擴增產物Fig.1 PCR products of the target gene

3.2 PpARI1 基因的序列分析

3.2.1 比對結果用DNAMAN 軟件將測序結果序列與預測序列進行比對, 其核苷酸序列的一致性高達99.83%. 氨基酸序列比對分析結果顯示, 二者只存在一個氨基酸的差異, 結果如圖2 所示.

3.2.2 PpARI1 的定位及結構分析

根據PpARI1 編碼區序列, 在GDR 網站中找到了PpARI1 基因的染色體結合位點. 位點位于scaffol上, PpARI1 基因的堿基序列從16 694 469～16 704 710 bp.

根據PpARI1 基因序列, 在GSDS 網站中檢索得到該序列的外顯子和內含子結構(見圖3).分析序列結果表明, PpARI1 基因具有15 個外顯子和14 個內含子.

3.2.3 PpARI1 編碼的氨基酸序列分析

使用ExPAsy 網站的在線程序Prot-Param Tool, 分析預測PpARI1 基因編碼的蛋白.結果如下: 該蛋白的等電點pI 為5.40, 屬于酸性蛋白; 分子量為66 726.45 Da, 蛋白的原子組成為C2883H4408N816O920S47; 帶正電的氨基酸(Lys+Arg)數量為69, 帶負電的氨基酸(Glu+Asp)數量為90, 不穩定系數為50.08, 推測其蛋白結構不穩定; 總平均疏水指數為-0.682. 由此可見, PpARI1 蛋白為親水性蛋白.

圖2 PpARI1 氨基酸序列與預測桃ARI1 氨基酸序列的多重比對結果Fig.2 Multiple alignment of the amino acid sequences between PpARI1 and the predicted ARI1

圖3 PpARI1 基因的結構分析Fig.3 Structural analysis of PpARI1 gene

3.3 PpARI1 基因正義表達載體的構建

將用新引物擴增的PCR 產物與pGM-T 連接后轉入大腸桿菌TOP10 感受態細胞, 測序正確后提取質粒, 用Xba Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切pGM-T-PpARI1 質粒, 回收目的基因序列, 如圖4(a)所示.

用相同的內切酶對pCAMBIAy1300 質粒進行雙酶切, 回收大片段, 并與目的基因序列相連接, 轉化大腸桿菌TOP10 感受態細胞. 挑選單克隆用特異性引物進行PCR 鑒定, 鑒定正確的進行搖菌, 提取質粒, 并用Xba Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切, 得到約1 800 bp 的小片段, 如圖4(b)所示. 測序結果完全正確, 說明表達載體pCAMBIAy1300-PpARI1 構建成功.

3.4 PpARI1 基因的農桿菌轉化

采用熱激法將pCAMBIAy1300-PpARI1 重組質粒轉化農桿菌感受態細胞, 挑取單克隆搖菌并提取質粒. 以質粒為模板進行PCR 鑒定, 得到的條帶大小與目的基因大小一致, 如圖5 所示. 這表明PpARI1 基因的正義表達載體已經成功轉化到農桿菌中.

圖4 重組質粒的雙酶切驗證Fig.4 Double enzyme digestion of the recombinant plasmids

圖5 pCAMBIAy1300-PpARI1 重組質粒轉化農桿菌的PCR 驗證Fig.5 Verification of the recombinant plasmid pCAMBIAy1300-PpARI1 in Agrobacterium by PCR

4 討 論

水蜜桃果實多汁, 具有潤肺、祛痰、清胃等功效, 其蛋白質、鐵元素含量高且富含多種維生素, 深受廣大消費者喜愛. 然而, 水蜜桃果樹開花期易受干旱脅迫, 造成嚴重減產; 果實在低溫運輸、貯藏過程中也易發生冷害, 影響貨架期. 在植物的發育過程中, E3 泛素連接酶參與了從胚胎發育到花器官產生幾乎所有的發育過程, 控制著植物生長發育和逆境脅迫響應等過程中的關鍵步驟[22].

RING 蛋白家族是E3 泛素連接酶的一類. 在環境脅迫條件下, 很多RING 結構域基因被誘導表達, 增強了植物對逆境的抵抗能力. Qin等[23]從擬南芥中鑒定出ATRF1 基因. 該基因編碼的氨基酸含有RING 典型結構域C3HC4, 能被鋁離子誘導表達. 將該基因在植物體內過量表達, 發現能明顯增強植物的抗鋁毒能力. Qi等[24]從番茄中分離出RING 基因. 經檢測發現其在野生番茄的所有組織中都能表達. 將該基因轉入擬南芥后, 能增強擬南芥的耐鹽性. 另有研究表明, 水稻中的CTR1 基因編碼一個具有E3 泛素連接酶活性的RING 蛋白. 將植株進行干旱脅迫處理后發現, RING 蛋白的基因表達量明顯升高, 再將其轉入擬南芥后, 轉基因擬南芥植株的抗干旱能力增強[25].

ARI1 基因屬于RING 結構域家族, 除了在大豆中發現其具有耐鋁毒性外, 其生理功能有待進一步驗證. 驗證基因功能最有效的方法就是轉基因技術. 本實驗采用柱式植物RNAout2.0 試劑盒法提取了水蜜桃果實總RNA, 有效避免了基因組DNA 的污染問題, 無多糖、蛋白等雜質, 純度較高. 由于擴增的目的基因較長, 為保證高準確率, 使用了高保真Pfu DNA 聚合酶. 為使PpARI1 基因能與pCAMBIAy1300 相連, 需要在PpARI1 基因兩端添加酶切位點. 由于pCAMBIAy1300 本身含有Kpn Ⅰ, Sac Ⅰ, Xba Ⅰ與BamH Ⅰ4 個酶切位點, 對PpARI1 基因進行酶切位點分析, 發現序列本身含有Kpn Ⅰ, 而pGM-T 載體中又含有Sac Ⅰ, 故選擇Xba Ⅰ與BamH Ⅰ. 在pCAMBIAy1300 表達載體中, 這兩個酶切位點距離最近, 因此在雙酶切定向連接時難度較大, 需要反復實驗, 確認體系中質粒與目的基因的濃度比例.

本研究最終得到了轉基因工程菌, 為進一步研究PpARI1 基因的分子生物學功能奠定了基礎, 進而為選育抗逆水蜜桃品種提供了理論依據.