除草劑脅迫下谷子脯氨酸含量及代謝酶活性的比較

楊艷君，馮志威，趙紅梅，陳林晶

（1.晉中學院生物科學與技術學院，山西晉中030600；2.山西省農業科學院，山西太原030031）

谷子（Setaria）又稱粟，是禾本科狗尾草屬最古老的作物之一，營養豐富，具有極高的保健及藥用價值[1-2]。相對常規谷[3-4]，雜交谷具有明顯的高產優勢[5-7]，但都存在除草難的問題。除草方法有多種，如化學除草，是以保護有益作物為目的、殺傷雜草的一項除草技術[8]。常用的除草劑品種為有機化合物類，其中，除草劑拿捕凈，又稱烯禾啶（sethoxydim），通常有20%拿捕凈乳油和12.5%拿捕凈機油乳劑2 種。但是，使用除草劑會對農作物產生脅迫，進而導致農作物體內發生復雜的生理生化變化[9-10]。脯氨酸（Pro）是植物蛋白質的組分之一，在高等植物中，常以游離狀態存在。大量的研究資料表明，農作物在受到干旱、鹽漬、低溫等脅迫后其體內常常會有大量脯氨酸的快速積累，積累的脯氨酸可以起到保護細胞的作用[11]。現已證明，農作物體內的脯氨酸有2 種合成途徑，根據其起始物質，可分為谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑，其中，吡咯琳－5－羧酸合成酶為谷氨酸合成途徑的關鍵酶[12]。趙貴林等[13]在研究干旱脅迫下水稻脯氨酸及代謝酶活性時得出，在受到脅迫后，水稻葉片中的脯氨酸快速積累，積累下的高含量脯氨酸可以使農作物在受脅迫時維持光合作用的正常進行。柯貞進等[14]研究表明，適當濃度的丙聚烯酰胺浸種可緩解干旱脅迫對谷子萌發和幼苗生長造成的傷害，增強谷子的抗旱性。李志華等[15]研究表明，除草劑對谷子安全，并可以起到有效控制谷田雜草的作用。目前，有關除草劑對雜交谷和常規谷脯氨酸含量及代謝酶活性影響的研究鮮見報道。

本研究通過2 因素4 水平試驗，研究在除草劑拿捕凈脅迫下，常規谷（晉谷21 號、晉谷59 號）和雜交谷（張雜谷5 號、張雜谷13 號）脯氨酸含量及代謝酶活性的變化，旨在為進一步研究除草劑對雜交種和常規種谷子脯氨酸含量及代謝酶活性的影響提供理論依據，為雜交谷的推廣奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試谷子品種為張雜谷5 號、張雜谷13 號、晉谷21 號和晉谷59 號。

1.2 試驗方法

試驗于2018 年5—9 月在山西省榆次區什貼鎮山莊頭村試驗田進行，試驗地前茬作物為馬鈴薯。試驗采用2 因素4 水平完全隨機設計，其中，2個因素分別為谷子品種（A）和拿捕凈濃度（B），因素A設4 個水平：A1.張雜谷5 號，A2.張雜谷13 號，A3.晉谷21 號，A4.晉谷59 號；因素B 設4 個水平：B1.0 倍濃度，B2. 0.5 倍濃度（1.25 mL/L），B3. 1.0 倍濃度（2.5 mL/L），B4.2 倍濃度（5.0 mL/L），其中，1.0 倍濃度為推薦濃度。共16 個處理組合，隨機安排小區，試驗區周圍設有保護行，每個處理重復3 次。播前統一灌水，統一旋耕。3～5 葉期時根據設計密度統一間苗、定苗。六七葉期時，谷子分別噴施4 種濃度的除草劑拿捕凈（12.5%拿捕凈機油乳劑）。7 d 后分別稱取4 種谷子的葉片各3 g 備用。每個小區重復5 次。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 脯氨酸含量測定 脯氨酸含量測定參照張憲政等[16]與職明星等[17]的方法進行。稱取葉片0.5 g，用3%磺基水楊酸5 mL 研磨，提取勻漿，移至離心管中，沸水浴提取10 min，冷卻，3 000 r/min 離心10 min，取2 mL 上清液，加入2 mL 蒸餾水、2 mL 冰醋酸和4 mL 酸性茚三酮，混勻置沸水浴中顯色1 h，冷卻后加入4 mL 甲苯，振蕩30 s，靜置分層，吸取紅色甲苯相，于波長520 nm 比色，記錄OD 值，以二甲苯為對照。最后從標準曲線上查得樣品測定液中脯氨酸的濃度。計算樣品中脯氨酸含量。

式中，A 為樣品中脯氨酸含量（μg/g）；C 為從標準曲線上查得的脯氨酸質量濃度（μg/mL）；V 為樣品稀釋體積（mL）；W 為樣品質量（g）。

1.3.2 吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性測定 吡咯琳-5- 羧酸合成酶（P5CS）活性測定參照KAVI 等[18]與韓曉玲等[19]的方法進行。

1.3.2.1 酶液提取 稱取葉片0.5 g，加入抽提液（100 mmol/L Tris-HCl pH 值7.2，20 mmol/L MgCl2、1 mmol/L DTT、1 mmol/L PMSF）5 mL，冰浴研磨，勻漿4 ℃冰凍7 000 r/min 離心20 min，吸取上清液，于4 ℃保存備用。

1.3.2.2 酶活性測定 取上述酶提取液1 mL，加入反應緩沖液1.6 mL（100 mmol/L Tris-HCl pH 值7.2，20 mmol/L MgCl2、5 mmol/L ATP、75 mmol/L 谷氨酸鈉），加入0.4 mmol/L NADPH 0.2 mL 啟動反應，30 ℃反應20 min，吸取上清液于535 nm 波長下比色，記錄OD 值，以未加ATP 的反應管作為空白對照。

1.4 統計分析

采用SAS 軟件對數據進行統計分析。對不同濃度除草劑之間、不同品種之間以及不同濃度拿捕草不同品種互作之間谷子的脯氨酸及代謝酶活性數據進行方差分析，對有差異者進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同品種對谷子葉片中脯氨酸含量及代謝酶活性的影響

將試驗數據進行基本描述性統計（表1），可以得出，在受拿捕凈脅迫后A1處理的脯氨酸含量及吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性最高，其后依次為A2、A3、A4處理。方差分析表明，不同品種谷子葉片中的脯氨酸及代謝酶活性均存在極顯著差異（P＜0.01）。多重比較結果表明（表1），A1、A2處理脯氨酸含量及吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性極顯著高于A3、A4處理，A1處理與A2處理脯氨酸含量及吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性無顯著差異，A3處理脯氨酸含量及吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性極顯著高于A4處理。

表1 不同谷子品種之間葉片脯氨酸含量和代謝酶活性的差異性比較

2.2 不同濃度拿捕凈對谷子葉片中脯氨酸含量及代謝酶活性的影響

從表2 可以看出，拿捕凈4 個濃度脅迫下谷子葉片中脯氨酸含量及吡咯琳-5-羧酸合成酶活性均隨著其濃度的升高依次增加。通過方差分析可以得出，不同濃度拿捕凈處理后谷子葉片中的脯氨酸含量及代謝酶活性均存在極顯著差異（P＜0.01）。多重比較結果表明（表2），B4（2 倍濃度）處理谷子脯氨酸含量及吡咯琳-5-羧酸合成酶活性極顯著高于其他濃度處理，B3（1 倍濃度）處理谷子脯氨酸含量及吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性極顯著高于B2（0.5倍濃度）和B1（0 倍濃度）處理，B2（0.5 倍濃度）處理谷子脯氨酸含量及吡咯琳-5-羧酸合成酶活性極顯著高于B1（0 倍濃度）處理。

表2 不同濃度拿捕凈處理對谷子葉片脯氨酸含量及代謝酶活性的影響

2.3 不同谷子品種在不同濃度拿捕凈處理下對谷子葉片中脯氨酸含量及代謝酶活性的影響

通過方差分析可以得出，不同品種在不同濃度拿捕凈處理下谷子葉片中脯氨酸含量存在極顯著差異（P＜0.01）。多重比較結果表明（表3），在2 倍濃度拿捕凈處理下A1B4、A2B4處理脯氨酸含量較高；在0 倍濃度拿捕凈處理下A4B1脯氨酸含量最低；在1 倍濃度拿捕凈處理下，A1B3、A2B3處理的脯氨酸含量極顯著高于A3B3、A4B3處理，A1B3、A2B3處理的脯氨酸含量無顯著差異，A3B3處理的脯氨酸含量極顯著高于A4B3處理；在0.5 倍濃度拿捕凈處理下，A1B2、A2B2處理的脯氨酸含量極顯著高于A4B2處理，但A1B2處理與A2B2處理間及A3B2處理與A4B2處理間的脯氨酸含量無顯著差異。

表3 品種和濃度互作對脯氨酸含量和吡咯琳-5-羧酸合成酶活性的影響

通過方差分析可以得出，不同品種在不同濃度拿捕凈谷子葉片中的吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性存在極顯著差異（P＜0.01）。多重比較結果表明（表3），在2 倍濃度拿捕凈處理下A1B4處理吡咯琳-5-羧酸合成酶活性最強；在0 倍濃度拿捕凈處理下A4B1處理吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性最低，A1B1、A2B1處理的吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性極顯著高于A3B1、A4B1處理，但A1B1、A2B1處理之間及A3B1、A4B1處理之間無顯著差異；在1 倍濃度拿捕凈處理下，A4B3處理的吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性極顯著高于A1B3、A2B3、A3B3處理，但A1B3、A2B3、A3B3處理的吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性無顯著差異；在0.5 倍濃度拿捕凈處理下，A1B2、A2B2處理的吡咯琳-5-羧酸合成酶活性顯著高于A4B2處理，但A1B2、A2B2處理之間及A3B2、A4B2處理之間的吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性無顯著差異。

從圖1 可以看出，在不同濃度拿捕凈脅迫下，4 種谷子葉片中的脯氨酸含量均呈現上升趨勢，且雜交谷整體上略高于常規谷。在0 倍濃度時，A1處理脯氨酸含量最高，然后依次為A2、A4、A3處理；在0.5 倍濃度時，A1處理脯氨酸含量最高，然后依次為A2、A4、A3處理，且4 種谷子的脯氨酸含量有小幅增長；在1 倍濃度時，A2處理脯氨酸含量最高，然后依次為A1、A4、A3處理，且4 種谷子的脯氨酸含量均有大幅度提高；在2 倍濃度時，A1處理脯氨酸含量最高，然后依次為A2、A3、A4處理，且4 種谷子的脯氨酸含量增長減緩。

從圖2 可以看出，在不同濃度拿捕凈脅迫下，4 種谷子葉片中的吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性均呈現上升趨勢，且雜交谷整體上略高于常規谷。在0 倍濃度時，A1處理吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性最高，然后依次為A2、A4、A3處理；在0.5 倍濃度時，A1處理吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性最高，然后依次別為A2、A4、A3處理，且4 種谷子的吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性有小幅增長；在1 倍濃度時，A2處理吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性最高，然后依次為A1、A4、A3處理，且4 種谷子的吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性均顯著提高；在2 倍濃度時，A1處理吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性最高，然后依次為A2、A4、A3處理，且4 種谷子的吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性增長減緩。

3 討論

本試驗結果顯示，在不同濃度拿捕凈脅迫下谷子的脯氨酸含量會發生改變，拿捕凈濃度越高，脅迫越強，脯氨酸含量越高；在不同品種之間谷子的脯氨酸含量不同，雜交谷的脯氨酸含量高于常規谷；在不同濃度拿捕凈脅迫下不同品種之間谷子的脯氨酸含量會發生改變，同一品種下，拿捕凈濃度越高，脯氨酸含量越高，抗逆性越強。秦嶺等[20]研究表明，植物體在受到干旱脅迫后體內常常會有大量脯氨酸的快速積累，積累的脯氨酸可以起到穩定生物大分子結構、降低細胞酸性及保護細胞結構等作用，這與本試驗與其結果一致。

在不同濃度拿捕凈脅迫下谷子的吡咯琳-5-羧酸合成酶活性會發生改變，拿捕凈濃度越高，脅迫越強，吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性越強；在不同品種之間谷子的吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性不同，雜交谷的吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性強于常規谷，且張雜谷5 號高于張雜谷13 號；在不同濃度拿捕凈脅迫下不同品種之間谷子的吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性會發生改變，同一品種下，拿捕凈濃度越高，吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性越強，抗逆性越強。脯氨酸含量的增多與吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性呈正相關，這與趙貴林等[13]的研究結果相似。

綜上所述，雜交谷脯氨酸含量及吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性高于常規谷；在一定范圍內谷子脯氨酸含量隨拿捕凈濃度增加而逐漸升高，脯氨酸含量越高，抗逆性越強；吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性隨著拿捕凈濃度升高而逐漸增強，其與脯氨酸含量呈正相關。其中，張雜谷5 號在2 倍濃度除草劑脅迫下，脯氨酸含量及吡咯琳-5- 羧酸合成酶活性最高，表現出較強的抗逆性。