模擬胃腸道消化過程中迷迭香提取物總酚及抗氧化活性變化

劉勝男,余敏敏,潘菁菁,申瑞玲,李 紅,相啟森

(鄭州輕工業大學食品與生物工程學院,河南鄭州 450001)

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)是一種原產于地中海沿岸和非洲北部的天然植物香辛料[1]。迷迭香富含萜類、酚類、黃酮類等多種活性物質[2-5],其中鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸、迷迭香酚等多酚類物質是迷迭香的主要活性成分[6-7]。國內外研究表明,迷迭香所富含的多酚類物質具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗腫瘤、延緩衰老等多種生理活性功能[8-10]。研究表明,胃腸道消化過程可能對多酚類物質的結構、含量及其抗氧化、抗炎等生理活性造成影響。Kahle等[11]研究發現,表兒茶素在腸液中會異構化生成兒茶素;Ryu等[12]發現覆盆子提取物中的花青素在體外胃消化過程中較穩定,而在腸消化時其含量降低了55%;陳希苗等[13]發現,山楂多酚在胃消化過程中穩定性較好,但在腸消化過程中易降解,含量顯著降低。因此,研究植物提取物在消化過程中的含量及活性變化對于揭示其活性功能具有重要意義。然而,目前關于迷迭香提取物在消化過程中的含量和活性變化規律方面的研究相對較少。

因此,本實驗通過研究迷迭香提取物多酚類物質在模擬胃腸道消化過程中的動態含量變化,并測定該提取物在模擬消化過程中的DPPH·清除能力、鐵還原能力(Ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)以及超氧陰離子自由基清除能力,分析抗氧化活性與總酚含量的相關性,以期為迷迭香在食品抗氧化、營養保健等方面的應用提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

迷迭香 亳州市雅麗百花茶有限公司;胃蛋白酶(P7000-100G,≥250 U/mg)、胰酶(P1750-100G,≥100 U/mg)、膽汁鹽和二甲基亞砜(DMSO) 美國Sigma公司;Folin-Ciocalteu試劑、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox) 上海源葉生物科技有限公司;超氧陰離子自由基測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、沒食子酸 上海阿拉丁試劑有限公司。

Multiskan GO型全波長酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;C012型多功能料理機 九陽股份有限公司;HH-S6型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;HH-8J型數顯恒溫水浴鍋 常州潤華電器有限公司;XD-52AA型旋轉蒸發儀 上海賢德實驗儀器有限公司;BSA224S-CW型電子天平 德國Sartorius公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 迷迭香提取物的制備 將迷迭香粉碎后,過40目篩,備用。準確稱取100.00 g迷迭香粉末,加入400 mL 80%(V/V)乙醇溶液,混勻后于室溫靜置提取2 h,過濾得上清液,連續提取2次,合并濾液,于40 ℃水浴下旋轉蒸發,所得濃縮液真空冷凍干燥24 h,得到迷迭香提取物,研磨,過100目篩后置于-18 ℃冰箱備用。

1.2.2 體外模擬消化 模擬胃腸消化過程參考Minekus等[14]的方法,略作修改。模擬胃液和腸液電解質儲備液的配方見表1。

表1 模擬胃液和腸液電解質儲備液Table 1 Preparation of electrolyte stock solutions for simulated gastric fluid and simulated intestinal fluid

分別取200 mL迷迭香提取物水溶液(1.0 mg/mL)、150 mL模擬胃液電解質儲備液、32 mL胃蛋白酶儲備液(25000 U/mL)和100 μL CaCl2溶液(0.3 mol/L),充分混勻,用1 mol/L HCl溶液調節pH至3.0,最后用去離子水補充體積至400 mL。將上述樣品于37 ℃、100 r/min的恒溫水浴條件下進行模擬胃消化反應,分別于0、30、60、90、120、150和180 min取樣,備用[14]。

分別取模擬胃消化3 h后150 mL樣品、82.5 mL模擬腸液電解質儲備液、37.5 mL胰酶溶液(800 U/mL)、18.75 mL膽汁鹽溶液(160 mmol/L)和300 μL CaCl2溶液(0.3 mol/L)并混勻,用1 mol/L NaOH溶液調節pH至7.0,最后用去離子水補充至300 mL。將上述樣品于37 ℃、100 r/min 的恒溫水浴條件下進行模擬腸消化反應,分別于0、30、60、90和120 min取樣,備用[14]。

1.2.3 總酚含量測定 取100 μL各個階段消化樣品,加入0.1 mL Folin-Ciocalteu試劑,混勻后避光反應6 min,依次加入1 mL 7%(V/V)Na2CO3溶液和0.8 mL去離子水并混合均勻,于室溫避光反應50 min。測定其765 nm處吸光度,以沒食子酸(0、25、50、100、200和300 μg/mL)為標樣繪制標準曲線,得標準曲線方程A=0.0026C(R2=0.994),其中A是765 nm處吸光度,C是沒食子酸的濃度,實驗結果表示為1 g迷迭香提取物所含有的沒食子酸當量(mg GAE/g DW)[13]。

1.2.4 模擬胃腸消化過程中迷迭香提取物的抗氧化活性測定

1.2.4.1 DPPH·清除能力的測定 取100 μL各個階段消化樣品,加入1.0 mL DPPH乙醇溶液(100 μmol/L),混勻后避光反應30 min,測定其517 nm處吸光度并計算清除率[15]。以Trolox梯度溶液(0、250、500、750、800 μmol/L)繪制標準曲線,得標準曲線方程A=0.1071C(R2=0.999),其中A是517 nm處吸光度,C是DPPH·的濃度。消化樣品的DPPH·清除能力表示為1 g迷迭香提取物中所含Trolox當量(mg Trolox/g DW)。清除率計算公式如下:

DPPH·清除率(%)=(A2-A1)/A0×100

式(1)

式中,A1為試驗組吸光度,A2為對照組(模擬消化液)吸光度,A0為空白組(DPPH·溶液)吸光度。

1.2.4.2 鐵還原能力(FRAP)的測定 取4.0 mL FRAP工作液,加入100 μL各個階段消化樣品和0.9 mL去離子水,混勻后于37 ℃避光反應30 min,測定其593 nm處吸光度[16]。以FeSO4(0、25、50、100、150、200、300 μmol/L)為標準品繪制標準曲線,得標準曲線方程A=0.0027C(R2=0.999),其中A是593 nm處吸光度,C是FeSO4的濃度。實驗結果表示為1 g迷迭香提取物中所含有的FeSO4當量(mmol FeSO4/g DW)。

1.2.4.3 超氧陰離子自由基清除能力的測定 分別取50 μL模擬胃消化樣品或腸消化樣品,按照抑制與產生超氧陰離子自由基試劑盒操作說明書進行測定,結果表示為1 g迷迭香提取物所清除超氧陰離子自由基能力的活力單位(U/g DW)。

1.3 數據統計分析

所有試驗均重復3次,采用SPSS for Windows 22.0軟件進行數據處理,采用最小顯著差異法(Least significant difference,LSD)進行顯著性分析,P<0.05表示差異顯著,采用Pearson correlation test進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 模擬胃腸消化過程中迷迭香提取物總酚含量的變化

模擬胃腸消化過程中迷迭香提取物總酚含量變化趨勢如圖1所示。在模擬胃消化階段(圖1A),迷迭香提取物消化產物中的總酚含量在30～90 min內顯著升高(P<0.05),而在90～180 min其總酚含量趨于穩定(P>0.05),180 min時其總酚含量較0 min時提高了17.88%,這與芒果、芹菜汁等在胃消化過程中的多酚含量變化規律相一致[17-18]。迷迭香提取物在模擬胃消化過程中總酚含量呈現升高的趨勢,可能是因為迷迭香提取物中存在結合態多酚,在酸性條件下被釋放出來,從而導致總酚含量升高[18]。

如圖1B所示,隨著模擬腸消化時間的延長,迷迭香提取物消化產物中總酚含量呈現降低的變化趨勢。與未經腸消化樣品相比,120 min時模擬腸消化所得消化產物中總酚含量降低了19.64%(P<0.05)。上述實驗結果與山楂、柑橘、藍莓等在模擬腸消化過程中的多酚含量變化規律相一致[13,19-20]。陳希苗等[13]發現,山楂多酚和黃酮含量均隨模擬腸消化時間的延長而顯著降低。造成上述試驗結果的原因可能是迷迭香所富含的鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸、迷迭香酚等主要多酚化合物結構中均含有酚羥基,而酚羥基在較高pH環境中不穩定,易發生降解并生成其他物質[21]。

圖1 模擬胃腸道消化過程中迷迭香提取物總酚含量變化Fig.1 Changes in total polyphenols contents of rosemary extract during the simulated gastrointestinal digestion注:不同字母表示差異顯著(P<0.05),圖2～圖4同。

2.2 模擬胃腸消化過程中迷迭香提取物抗氧化活性變化規律

2.2.1 模擬消化過程中迷迭香提取物清除DPPH·能力變化 由圖2A可知,未進行模擬胃消化時,迷迭香提取物消化產物對DPPH·的清除能力為82.50 mg Trolox/g;經模擬胃消化180 min后所得樣品中迷迭香提取物消化產物DPPH·清除能力較0 min時提高了20.36%(P<0.05),而迷迭香提取物DPPH·清除能力隨模擬腸消化時間的延長而呈現下降趨勢(圖2B)。經模擬腸消化120 min后,迷迭香提取物消化產物的DPPH·清除能力較0 min時顯著降低了74.08%(P<0.05)。模擬胃腸道消化過程中迷迭香提取物消化產物對DPPH·清除能力的變化規律與其總酚含量的變化規律相一致,這與Lingua等[22]研究結果相類似。

圖2 迷迭香提取物模擬胃腸道消化樣品對DPPH·清除能力變化Fig.2 Changes in DPPH· radical scavenging activity of rosemary extract during the simulated gastrointestinal digestion

2.2.2 模擬消化過程中迷迭香提取物鐵還原能力(FRAP)變化 如圖3A所示,在模擬胃消化階段,迷迭香提取物消化產物的鐵還原能力隨消化時間的延長而增強。消化180 min后,消化產物的FRAP由消化前的1.93 mmol FeSO4/g DW顯著升高至2.17 mmol FeSO4/g DW,提高了11.76%(P<0.05)。如圖3B所示,在模擬腸消化階段,消化產物的FRAP則隨著消化時間的延長而顯著下降(P<0.05)。

未進行模擬腸消化前,迷迭香提取物消化產物的FRAP為2.49 mmol FeSO4/g DW,消化120 min后其FRAP顯著降低了52.13%(P<0.05)。綜合分析圖1和圖3試驗結果,模擬胃腸道消化過程中迷迭香提取物消化產物的FRAP變化規律與其總酚含量變化趨勢相一致。

圖3 模擬胃腸道消化過程中迷迭香提取物鐵還原能力變化Fig.3 Changes in FRAP values of rosemary extract during the simulated gastrointestinal digestion

2.2.3 模擬消化過程中迷迭香提取物超氧陰離子自由基清除能力變化 如圖4A所示,在模擬胃消化過程中,迷迭香提取物消化產物對超氧陰離子自由基的清除能力隨消化時間的延長而增強,模擬消化180 min所得樣品超氧陰離子自由基清除能力較未消化樣品提高了22.07%(P<0.05)。如圖4B,在模擬腸消化過程中,迷迭香提取物消化產物對超氧陰離子自由基的清除能力隨消化時間的延長而顯著降低(P<0.05)。模擬腸消化120 min時所得消化產物的超氧陰離子自由基清除能力較未消化樣品降低了50.00%(P<0.05)。

圖4 模擬胃腸道消化過程中迷迭香提取物超氧陰離子自由基清除能力變化Fig.4 Changes in scavenging activity of rosemary extract during the simulated gastrointestinal digestion

2.3 消化樣品中總酚含量與其抗氧化活性之間的相關性分析

由表2和表3可知,在模擬胃腸道消化過程中,迷迭香提取物消化產物的DPPH·清除能力、FRAP以及超氧陰離子自由基清除能力與其總酚含量之間呈良好的正相關性(P<0.01)。此外,迷迭香提取物DPPH·清除能力和FRAP之間也存在極顯著的相關性(P<0.01),說明總酚含量能夠較好地反映迷迭香提取物的DPPH·清除能力和FRAP。

表2 模擬胃消化過程中迷迭香提取物總酚含量與其抗氧化活性之間的相關性分析Table 2 Correlation analysis between total phenol contents of rosemary extract and its antioxidant activity potential during the simulated gastric digestion

表3 模擬腸消化過程中迷迭香提取物總酚含量與其抗氧化活性之間的相關性分析Table 3 Correlation analysis between total phenol contents of rosemary extract and its antioxidant activity potential during the simulated intestinal digestion

3 結論與討論

本實驗結果表明,迷迭香提取物模擬胃腸道消化產物中總酚含量隨模擬胃消化時間的延長而呈現升高的趨勢,但隨模擬腸消化時間的延長而呈現下降的趨勢。這可能是由于模擬胃消化環境促進了迷迭香結合多酚的釋放,從而使其含量升高;但具有較高pH的模擬腸消化環境可能導致迷迭香多酚類物質發生降解,從而造成總酚含量降低。此外,在模擬胃腸道消化過程中,迷迭香提取物消化產物對DPPH·、超氧陰離子自由基的清除能力及其FRAP與未消化前相比均顯著升高(P<0.05);而經模擬腸消化120 min后,其消化產物對DPPH、超氧陰離子的清除能力及其FRAP均顯著降低(P<0.05),其抗氧化活性變化趨勢與總酚含量變化呈良好的正相關性。鼠尾草酸、迷迭香酸和鼠尾草酚等迷迭香主要多酚組分在消化過程中的結構、活性變化及其機制均有待于在今后的工作中進行深入研究。