植物乳桿菌活菌片劑產品的功能性與穩定性研究

孫 盛,朱 珺,陳作國,李寶磊,陳 蘇,李言郡

(杭州娃哈哈集團有限公司研究院，生物工程研究所,浙江杭州 310018)

目前,國外益生菌產品以食品和膳食補充劑兩種類型為主[1],其中,含有益生菌的膳食補充劑以具有功能性宣稱的片劑、粉劑和膠囊居多,部分產品也添加了其他功能性成分,如提取物、益生元、發酵副產物及其他生物活性物質等[2]。大部分產品菌株標識清晰,有明確的菌種名和活菌數量。我國益生菌相關領域研究起步較晚,益生菌產品與國外同類產品相比,基礎理論、生產技術與行業規范都還比較落后[1],市場上的益生菌產品質量參差不齊[3],產品標識也較為混亂,部分產品缺乏明確的菌株或有效活菌數的標識說明,多數產品只以出廠菌數進行標識。益生菌的益生功效在消費者體內的有效發揮必須依賴于對其充分的功能研究,有效劑量的確定以及在貨架期儲藏過程中活菌數的維持。產品中的活菌數量不穩定,其功能就會打折扣,嚴重影響益生菌產品的功效發揮。因此,結合益生菌產品的功能特性與儲藏穩定特性開展研究尤為重要。

益生菌和益生元在乳制品、飲料、奶粉、保健食品和飼料等領域都有著廣泛應用[4-5],其作為膳食補充劑通過選擇性地刺激腸道中定植微生物的生長和代謝,提高腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌含量,從而達到調節腸道菌群平衡,改善功能性便秘的目的[6]。益生元和益生菌聯合使用兼具兩者的雙重功效且能發揮協同效應,從而更好地發揮益生功能。益生元是指一種不易消化的無生命的食物成分,通過調節腸道菌群對宿主健康產生有益作用[7],主要有低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、水蘇糖、棉子糖等,此外多糖類物質中的抗性淀粉、L-阿拉伯糖、菊粉、乳果糖、葡聚糖等,多元醇類中的甘露醇、木糖醇、山梨醇、乳糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇等也屬于益生元[8]。這些益生元功能相同,但因結構、組成、特性不同,在實際應用中需要針對食品特性和益生菌特性來選擇最合適的益生元[9]。益生元除了作為腸道微生物營養物質,促進其生長,還能夠選擇性激活腸道中有益菌的代謝功能,使腸道菌群向有益于宿主健康的方向發展,改善腸道功能[10]。

在前期研究的過程中,我們發現了一株植物乳桿菌,并命名為植物乳桿菌581,它是從四川泡菜中分離得到,經研究發現具有優良的生長特性和產酸特性,能在高pH和膽鹽濃度下保持較高活性,黏附性高,并具有改善便秘、潤腸通便的功效,可以應用于發酵功能食品中。本研究以植物乳桿菌581為研究對象，通過檢測植物乳桿菌581的生長曲線和終點pH評價其對不同益生元的利用效率，采用小鼠便秘模型評估低聚果糖和植物乳桿菌581制成的片劑產品的功效，通過監測產品在4、28 ℃貯存6個月的活菌數、水分含量和水分活度評價產品穩定性，為其應用于益生菌活菌片劑產品開發提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌 581 來自娃哈哈菌種保藏中心,在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)鑒定保藏;遠交系昆明SPF級小鼠雄性(體重18～22 g,6～8周齡,SCXK(浙)2018-0003) 購自浙江省杭州杭斯生物科技有限公司;小鼠維持飼料 浙江省杭州杭斯生物科技有限公司;復方地芬諾酯 常州康普藥業有限公司;MRS培養基 英國Oxoid生物試劑有限公司;不同益生元來源如表1所示。

表1 不同益生元原料來源Table 1 Sources of different prebiotic raw materials

Baker Type B2 SterilGARD III生物安全柜 美國BAKER公司;Delta 320 pH計 瑞士METTLER TOLEDO公司;DU800型紫外分光光度計 美國Beckman公司;Eppendorf 5810 R型離心機 德國Eppendorf公司;Aqualab 4TE型水分活度儀 美國Decagon AquaLab公司;HR83 Halogen水分含量測定儀 瑞士METTLER TOLEDO公司;HSZP35型高速壓片機 上海天峰制藥設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 片劑配方中益生元的篩選 配制不同碳源的MRS培養基溶液,121 ℃,15 min高壓蒸汽滅菌備用。不同碳源分別包括2%添加量的葡萄糖、低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、L-阿拉伯糖、乳果糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇。

篩選方法參照張芳[11]的方法,略有改動。將植物乳桿菌581菌株以1%的接種量接種到含有MRS液體培養基的試管中，在37 ℃下培養,于培養的0～10 h每隔2 h取樣測定光密度值(OD600),培養10 h時取樣測定pH,每個樣品三次重復。

1.2.2 片劑制備 植物乳桿菌581經37 ℃發酵16 h,-30 ℃凍干72 h后制成菌粉,采用平板培養法進行活菌計數。將植物乳桿菌581(2×1010CFU/片)、低聚果糖和其他輔料(見表3)混合后,用HSZP35高速壓片機(轉速15 r/min)制成片劑(2.0 g/片,1.7 mm)。

表2 產品配方表Table 2 Product formulation table

1.2.3 通便功能實驗 為了驗證含有植物乳桿菌581的產品是否具有潤腸通便、緩解便秘的功效,研究采用復方地芬諾酯建立的小鼠便秘模型,參照《保健食品檢驗與評價技術規范》中相應方法[12]開展通便功能實驗。

動物飼養保持環境溫度為(21±2) ℃,濕度為30%～70%,12 h光照交替,自由攝入小鼠維持飼料和飲水。昆明小鼠自購入起適應7 d后,按體重進行隨機分組,共分為4組,每組12只。分組包括對照組、模型組、益生菌組、片劑產品組。其中,益生菌組灌胃植物乳桿菌581,灌胃劑量為6.67×109CFU/kg小鼠體重。片劑產品組灌胃片劑產品,灌胃劑量為0.67 g/kg小鼠體重(其中所含植物乳桿菌581劑量同益生菌組),相當于人體服用劑量1片/d。對照組和模型組每天灌胃與受試組等體積的0.85%的生理鹽水溶液。受試樣品給喂7 d后,除對照組外,其余各處理組給予復方地芬諾酯懸液(10 mg/kg小鼠體重),0.5 h后,灌胃墨汁,觀察并記錄每只小鼠的首粒排黑便時間、6 h內排黑便的粒數及重量。實驗期間每7 d對小鼠體重進行檢測。

1.2.4 產品的穩定性測定 對壓片產品進行貯藏穩定性測試。片劑產品用鋁箔袋真空熱封包裝后,分別放置于4 ℃和室溫28 ℃環境下貯存。每月測定壓片產品的活菌數、水分含量、水分活度及其他感官指標,連續測定6個月,每個樣品三次重復。

1.2.5 產品穩定性指標測定 將壓片產品用研缽研碎后,稱取1 g溶于9 mL 0.85%生理鹽水中,取1 mL依次進行梯度稀釋,稀釋至10-7,取100 μL于含有固體MRS培養基的平皿進行涂布,放于37 ℃培養箱培養48 h,計數;稱取1 g用水分活度儀檢測壓片產品水分活度;稱取0.5 g用水分含量測定儀檢測壓片產品水分含量。每個樣品三次重復。

1.2.6 統計分析 測定指標均表示為“平均值±標準偏差”。顯著性分析采用SPSS 17.0軟件中的Duncan’s多重比較檢驗法進行分析。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌581對不同益生元的利用特性

比較植物乳桿菌581對不同種類益生元的利用特性。由圖1可知,植物乳桿菌581對低聚果糖和低聚異麥芽糖的利用效果最好,生長速率最快,其次為甘露醇和低聚半乳糖。L-阿拉伯糖、赤蘚糖醇、木糖醇、麥芽糖醇基本不能被植物乳桿菌581有效利用。

圖1 不同益生元對植物乳桿菌581生長曲線的影響Fig.1 Effect of different prebiotics on the growth curve of L. plantarum 581

植物乳桿菌581是一株產酸能力較強的乳酸菌。發酵終點的產酸強度同樣也反應了菌株的生長情況。由圖2可知,植物乳桿菌581對低聚果糖、低聚異麥芽糖、甘露醇的利用效果最好,終點酸度最低,與生長曲線結果基本一致。說明低聚果糖促進植物乳桿菌581生長的能力較優,且經過文獻調研低聚果糖具有一定的潤腸通便功能[13-15],基于581菌株對不同種類益生元的利用特性及成本等其他因素綜合考量,選取低聚果糖作為與581進行配伍的益生元,并完成產品配方制定與壓片產品試制。

圖2 不同益生元對植物乳桿菌581產酸情況的影響Fig.2 Effect of different prebiotics on the acid production of L. plantarum 581注:標注*表示與葡萄糖相比具有顯著性差異,P<0.05; 標注**表示與葡萄糖相比具有顯著性差異,P<0.01。

2.2 通便功能實驗

由表3可知,各處理組小鼠體重與對照組相比均無顯著差異(P>0.05),說明壓片產品對小鼠生長狀況無影響。

表3 不同處理組小鼠的體重變化情況Table 3 Body weight change of mice in different treatment groups

受試樣品給喂7 d后,進行小鼠排便情況測定。由表4可知,與對照組相比,模型組小鼠的首次排黑便時間極顯著增加(P<0.01),6 h排黑便粒數和排黑便質量降低(P=0.085,P=0.078),表明采用復方地芬諾酯懸液灌胃制造便秘模型造模成功。

表4 不同處理組小鼠的排便情況Table 4 Defecation of mice in different treatment groups

與模型組相比,灌胃益生菌與灌胃益生菌片劑產品的小鼠首次排黑便時間顯著降低(P<0.05,P<0.01),同時6 h排黑便粒數顯著增加(P<0.05)。其中,片劑產品組的首次排黑便時間、6 h排黑便粒數和質量三項指標均優于益生菌組。表明采用經過篩選的益生元與益生菌復配產品的功能更優于單獨益生菌的使用。

2.3 片劑產品的穩定性跟蹤

檢測含有植物乳桿菌581與低聚果糖的益生菌片劑產品的穩定性。在0～6個月的儲藏期限內,產品的外觀、色澤均無明顯變化。

產品的水分含量與水分活度在4 ℃與28 ℃貯藏條件下均呈現先減小后增大的趨勢(表5)。產品的活菌數在4 ℃貯藏條件下基本無顯著變化,始終維持在1×1010CFU/g左右。在28 ℃儲藏條件下,活菌數隨著貯藏時間的延長而降低,至6個月時活菌數降至103CFU/g(表6)。說明含有植物乳桿菌581的益生菌片劑產品適宜在4 ℃進行貯藏。

表5 0～6月片劑產品水分含量與水分活度的變化情況Table 5 Changes in moisture content and water activity of tablet products of 0～6 months

3 討論與結論

2011年國際益生菌與益生元研究會對益生元進行較詳細的闡述,認為益生元主要特點為不被消化、能被腸道細菌發酵、能選擇性地刺激腸道菌群的生長和(或)活性[13]。益生元的種類多樣,不同益生元促進菌株生長狀況存在差異,本研究發現植物乳桿菌581對低聚果糖的利用率較高。低聚果糖一般由1～3個果糖基通過糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結合生產的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖等的混合物。研究表明,攝入低聚果糖具有一定緩解便秘的作用,但需達到一定有效劑量[14]。王宇[15]研究報道了便秘患者需服用低聚果糖5 g/d,連續7 d后可顯著改善排便狀況。本研究中低聚果糖服用量相當于1 g/d,遠低于有效劑量。

植物乳桿菌581菌株分離自四川泡菜樣品,本身具有一定的潤腸通便功能。同時,研究發現,片劑產品組小鼠的首次排黑便時間、6 h排黑便粒數、6 h排黑便質量均優于同等菌濃度的益生菌組,表明低聚果糖能夠促進植物乳桿菌581更好的發揮潤腸通便功能,功能效果更優于單獨益生菌的使用。

對于益生菌類片劑產品而言,保證其功能性的關鍵是在貨架期內保證其足夠的活菌菌數。FAO與WHO將益生菌定義為“當攝入足夠量時對宿主能發揮有益功效的一類活的微生物”,其中也強調了活菌的概念[16]。目前,由于國家相關法規的缺乏或不健全,市售的部分益生菌類產品僅以出廠時活菌數進行標示,不能保證儲藏標識條件下貨架期內的活菌數;或既缺乏有效劑量的標識,也無法保證貨架期內可否達到有效劑量。因此,本研究在完成產品功能性評價的同時,對產品的穩定性也進行了研究。

益生菌片劑產品的水分含量,尤其水分活度對產品的穩定性有一定的影響。產品中包含的水可分為自由水與結合水,其中自由水一般指細胞內、細胞間可自由流動、參與物質代謝并為微生物所利用的水,由水分活度表征[17]。本研究對6個月儲藏期內產品的水分含量與水分活度變化進行了追蹤實驗,其中產品的水分活度在0.20～0.26之間,期間呈現先降低后增高的趨勢。研究同時發現,在28 ℃貯藏條件下,產品活菌數隨著貯藏周期呈明顯下降趨勢。Lone等[18]針對嗜酸乳桿菌(LA-5)在不同水活度條件下(Aw=0.11、0.22、0.32、0.43)進行3個月的穩定性跟蹤,實驗結果顯示,隨水活度的降低菌粉產品的穩定性明顯提高。Satu等[19]報道了鼠李糖乳桿菌LGG在Aw=0.22條件下儲藏14個月活菌數下降約3.5個數量級,而在Aw=0.11條件下菌數基本無顯著變化。與現有文獻報道相比較,可以通過降低片劑產品水分活度來增加產品的穩定性。此外,片劑類益生菌產品不同于粉劑產品,其在壓片過程中形成的壓力對菌粉的活力保持存在影響也可能是本研究中產品活菌數降低的原因之一[20-21]。后續研究將考慮從多方面進行改善,包括優化輔料篩選,降低產品水分活度,優化壓片工藝,添加壓力緩沖類輔料[22]或優化產品包裝工藝與包裝材質等,提高貨架期內產品的穩定性。

本研究表明,植物乳桿菌581可利用低聚果糖作為碳源來源,在多種益生元中應用效果最優。以此為依據選擇低聚果糖為主要配方成分,經動物實驗研究表明,與植物乳桿菌581在體內可發揮協同作用。以人體服用量為1片/d的劑量進行動物實驗研究,結果表明該片劑產品對小鼠的首次排黑便時間、6 h排黑便粒數和質量均有顯著改善的效果,具有良好的潤腸通便的功能。本款產品在4 ℃儲存可保證其活菌數與優良的功能性。