桑樹SSR-PCR反應體系的優化

劉玲 陳祥平 范小敏

摘要：為了建立經濟穩定的桑樹簡單重復序列（SSR）-PCR反應體系，為SSR分子標記在桑樹研究中更廣泛地應用提供試驗基礎，采用L16（45）正交試驗設計和單因素試驗，對桑樹SSR-PCR反應體系中的模板DNA濃度、引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度和rTaq酶用量5個因素的4個水平進行優化分析，并比較這5個因素的不同濃度對擴增效果的影響。結果表明，各因素水平變化對反應體系的影響大小依次為Mg2+、dNTPs>引物>模板DNA>rTaq酶。研究最終確立了最佳反應體系，即在10 μL反應體系中，含有1.5 μL 10～20 ng/μL DNA模板、0.4 μL 25 mmol/L Mg2+、0.5 μL 2 mmol/L dNTPs、各0.15 μL 20 μmol/L正反向引物、0.1 μL 5 U/μL rTaq酶和1 μL 10×loading buffer。通過穩定性檢測，表明該體系能夠用于桑樹的SSR分析。

關鍵詞：桑樹;正交試驗設計;單因素試驗;SSR-PCR反應體系優化

中圖分類號： S888.2 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0045-05

桑樹是桑科（Moraceae）桑屬（Morus L.）的多年生木本植物，是重要的經濟植物，桑葉是家蠶的主要飼料。我國地域遼闊，生態環境各異，經過長期的自然選擇和人工選育，形成了非常豐富的桑樹種質資源。因此，研究桑樹的遺傳多樣性及其親緣關系對桑樹的栽培育種、良種選育等有重要意義。

簡單重復序列（simple sequence repeats，簡稱SSR）DNA，又稱微衛星DNA（microsatellite DNA），是由Moore和Terer等于1991年提出的，它是以1～6 bp核苷酸為重復單位而多次串聯重復組成的DNA序列。SSR具有多態性高、試驗操作簡單、共顯性等優點，被廣泛應用于植物的分子連鎖圖譜構建、基因定位、品種遺傳多樣性和群體結構分析、純度鑒定、雜種優勢的預測等[1]。

SSR是一種基于PCR技術的分子標記，試驗結果易受反應組分的影響，為了確保試驗結果的準確性和重復性，建立和優化SSR-PCR反應體系是非常必要的。目前，應用SSR分子標記研究桑樹種質資源遺傳多樣性等方面的報道較少，關于桑樹SSR-PCR反應體系優化的研究僅見羅義維等報道的采用正交設計試驗的優化過程[2]。本研究參考已有的桑樹SSR研究[2-7]，采用正交試驗和單因素優化試驗結合的方法，對桑樹SSR-PCR反應體系中的模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和rTaq酶5個因素的4個水平進行優化分析，以期建立經濟、實用、穩定的反應體系，為SSR分子標記在桑樹研究中更廣泛地應用提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗材料采自四川省絲綢科學研究院桑樹種質資源圃，詳見表1。選擇桑樹品種豐臺作為體系優化用的DNA模板。引物序列參照Aggarwal等的研究[8-10]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，詳見表2。PCR反應所用的Mg2+、dNTPs、rTaq酶、DNA marker和10×loading buffer均購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 桑樹總DNA提取及質量檢測 桑葉總DNA采用2種方法從用0.15 g硅膠干燥的桑葉中提取，一種是稍加改進的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[11]，另一種是在用4×CTAB提取前，先用去糖緩沖液抽提。取3 μL提取的DNA樣品，在1%瓊脂糖凝膠中電泳20 min，電泳完畢后在WFH-201B紫外反射透射儀中觀察DNA條帶。利用KAIAO K5500微量紫外分光光度計檢測DNA濃度，之后于-20 ℃保存。

1.2.2 PCR擴增及產物的電泳檢測 PCR反應在Thermal Cycler（上海山富科學儀器有限公司生產）上進行。PCR反應體系總體積為10 μL，包括Mg2+、dNTPs、rTaq聚合酶、正反向引物、模板DNA和10×loading buffer。PCR反應程序參照趙衛國的報道[12]，采用降落PCR：95 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，63 ℃退火1 min，每個循環降低0.5 ℃，72 ℃延伸 1 min，16個循環;94 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，24個循環;72 ℃延伸5 min。反應結束后控制溫度在 10 ℃。

將擴增產物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上檢測。進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時，在DYY-6C型穩壓穩流電泳儀上，于200～220 V預電泳10～20 min。預電泳完畢，垂直平穩地拔出凝膠中的梳子，上樣10 μL（3 μL ddH2O，3 μL 6×loading buffer，4 μL PCR產物），上樣完畢后，在 120 V 電壓下電泳，待溴酚藍指示劑跑到下層瓊脂糖封口處時停止電泳，用時大約為1 h 40 min。采用銀染法（1.0 g/L AgNO3）染色，并在顯色液（在200 mL蒸餾水中加4 g NaOH、0.08 g Na2CO3和0.8 mL甲醛）中顯色3～5 min至電泳條帶清晰可見，用數碼相機拍照并保存圖片。

1.2.3 SSR-PCR反應體系的建立及優化 對于PCR反應體系中的5個因素（模板DNA濃度、引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度和rTaq酶用量），每個因素分別設置4個水平，詳見表3。

1.2.3.1 正交試驗 采用L16（45）正交設計，共16個反應體系（表4）。除表4中的變化因素外，每管還含有1 μL 10×buffer，引物為Mulstr-l，每個反應體系設2次重復。

1.2.3.2 單因素試驗 根據正交試驗確定的最佳反應體系，依次優化Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度、rTaq酶用量和模板DNA濃度5個單因素，每個水平設2次重復。當其中1個因素水平變化時，體系中其他成分的水平保持不變。

1.2.4 退火溫度的優化 以確定的最佳反應體系為基礎，以提取的豐臺DNA作為模板，對引物Mulstr-l的退火溫度進行優化篩選，設定退火溫度范圍為（55±63） ℃，根據PCR儀自動生成的12個溫度梯度進行PCR擴增，擴增產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。

1.2.5 最佳反應體系穩定性檢測及應用 選擇2個桑樹材料嘉陵16號、樂山花桑，選擇2對引物，對優化出的反應體系進行穩定性檢測，每個樣品、每對引物設4個重復。選擇4對引物，用優化得到的反應體系，以7份桑樹DNA為模板進行SSR擴增。

2 結果與分析

2.1 桑樹基因組DNA的提取結果

如圖1所示，采用4×CTAB法提取桑樹總DNA的結果顯示，點樣孔明亮，說明有糖類等雜質，并且部分材料拖尾比較嚴重;而在加入提取液之前加入去糖緩沖液得到的DNA，點樣孔沒有雜質污染，只有輕微拖尾，說明去糖緩沖液能夠有效去除桑葉中的多糖等雜質，提取得到的DNA更純，能夠滿足SSR試驗要求。

2.2 SSR-PCR優化反應體系的直觀分析

由SSR-PCR正交試驗結果（圖2）可以看出，16個反應體系的擴增結果差異明顯。第1、6、14、15組合存在非特異性擴增條帶，且目的條帶擴增不完全;第2、9、11、16組合的擴增結果不穩定，2次重復擴增出的條帶不一致，且有非特異性擴增條帶;第5組合條帶清晰，但是目的條帶擴增不完全;第4、7、8、10、12、13組合的目的條帶擴增完全，但是第8、12組合的背景較深，第10、13組合2個重復中1個重復的目的條帶較淺;第4、7組合的目的條帶擴增完全、清晰、重復性好。綜合每組的2個重復，以及從經濟節約的角度考慮，選擇第7組合為最優體系，即10 μL反應體系中，含有1.5 μL 10～20 ng/μL DNA模板，各0.20 μL 20 μmol/L正反向引物，1.0 μL 25 mmol/L Mg2+，0.5 μL 2 mmol/L dNTPs，0.20 μL 5 U/μL rTaq酶和1 μL 10×loading buffer，用ddH2O補至10 μL。

為了進一步證明對試驗結果初步判斷的準確性，根據李志勇等的方法[13]對正交設計試驗中的各組分濃度組合進行分析，結果見表5，其中k值代表某因子在某水平下參與反應所產生的擴增條帶數的平均值。在本研究中，5個因素在設定的4個水平下對結果的影響由大到小依次為Mg2+、dNTPs濃度>引物濃度>模板DNA濃度>rTaq酶用量。

k值反映了影響因素各水平對反應體系的影響情況，k值越大，反應水平越好。模板DNA濃度以1水平最好，引物濃度以4水平最好，Mg2+濃度以3水平最好，dNTPs濃度以1、2水平最好，rTaq酶用量以3、4水平最好。因此可見，桑樹 SSR-PCR的最佳反應體系為1 ng/μL模板DNA+0.5 μmol/L 引物+ 2 mmol/L Mg2++0.10 或 0.15 mmol/LdNTPs+0.15或0.2 U/μL rTaq酶。綜合分析第4、7、8、12組合試驗設計中每個因素的水平和實際擴增效果，認為第8組合每個因素的水平與理論值最接近，因此，分別以第7、8組反應體系為基礎進行單因素優化試驗。

2.3 單因素優化的結果分析

以第8組合為基礎進行單因素優化試驗，結果顯示，電泳圖背景深，主帶不明顯，無法讀帶（圖略）。說明理論得出的最佳體系的效果需要進一步檢驗優化，同時也反映理論與實際存在一定的差距。

以第7組合為基礎，進行單因素優化。如圖3所示，當模板DNA濃度為2.5 ng/μL時，目的條帶擴增不完全;當模板DNA濃度為1.0、2.0 ng/μL時，2個重復的擴增結果不穩定。綜合4種濃度的電泳結果，選擇1.5 ng/μL作為模板DNA的最佳濃度。當引物濃度為0.2、0.4 μmol/L時，擴增結果不穩定;當引物濃度為0.5 μmol/L時，電泳背景較深;當引物濃度為0.3 μmol/L時，有清晰的目的條帶。因此，確定引物的最佳濃度為0.3 μmol/L。當Mg2+濃度大于1.5 mmol/L時，擴增不穩定;當Mg2+濃度為1.0、1.5 mmol/L時，都能擴增出明顯的條帶;但當Mg2+濃度為1.5 mmol/L時的背景較深，所以選擇1.0 mmol/L為Mg2+的最佳濃度。當dNTPs濃度為0.15、0.20 mmol/L時，條帶擴增不穩定;當dNTPs濃度為0.10、0.25 mmol/L時，都有清晰的目的條帶。從經濟節約角度考慮，選擇0.1 mmol/L為dNTPs的最佳濃度。當rTaq酶用量為0.15、0.2 U/μL時，存在非特異性擴增;當rTaq酶用量為0.05 U/μL時，目的條帶清晰且重復性好，因此確定rTaq酶的最佳用量為0.05 U/μL。

以上結果表明，正交設計能夠考慮各因素間的交互作用，單因素試驗可以對反應體系中每個因素的不同水平進行直觀分析[14]。與正交試驗相比，在單因素試驗中，除了模板DNA濃度、dNTPs濃度相同外，引物濃度、Mg2+濃度和酶用量都有所降低。綜合2種試驗結果，確定在10 μL桑樹SSR-PCR反應體系中，5個因素分別為1.5 ng/μL模板DNA，各 0.3 μmol/L 正、反向引物，1.0 mmol/L Mg2+，0.1 mmol/L dNTPs，0.05 U/μL rTaq酶。

2.4 最適退火溫度的確定

如圖4所示，在不同退火溫度下，擴增效果存在差異。退火溫度為55.0、56.6、57.5 ℃時，都能擴增出目的條帶;退火溫度為55.8 ℃時，2個重復出現擴增不穩定的情況;退火溫度高于58.5 ℃時，擴增的條帶數減少，PCR產物量較低。從主帶清晰度及背景深淺來考慮，引物Mulstr-l的退火溫度選擇56.6 ℃為宜。因此，引物Mulstr-1優化后的PCR反應程序如下：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s，56.6 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸60 s，37個循環;72 ℃延伸5 min，反應結束后保存在10 ℃。

2.5 最佳反應體系的穩定性檢驗及其應用

用2個桑樹材料嘉陵16號、樂山花桑，選擇MulSTR5、Mulstr-l這2對引物，對優化出的反應體系進行穩定性檢驗，每個樣品、每對引物設4次重復。由圖5可以看出，2個樣品的4次重復都能夠穩定地擴增出明顯的條帶，說明該優化體系穩定可靠。

采用MulSTR5、MulSTR4、Mul3SSR197和Mul3SSR183這4對引物，利用優化后的SSR-PCR反應體系，對7份桑樹種質進行擴增。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果顯示，這4對引物都獲得了清晰的條帶（圖6），表明該反應體系的特異性、可重復操作性和穩定性較好。

3 討論與結論

桑樹是我國重要的經濟作物，優化并建立適合桑樹的SSR-PCR反應體系，是SSR標記在桑樹中應用的重要基礎。目前對SSR-PCR體系優化的方法有單因素設計和正交設計等。正交設計能夠分析因素間的交互作用，但是由于其試驗體系較小，受到的試驗操作誤差較大，而且也不能顧及個別因素的影響，而單因素試驗正好能夠彌補正交試驗的不足[15]。本研究通過綜合考慮正交試驗和單因素優化試驗的方法，對PCR反應中的5個因素進行優化，得到桑樹SSR-PCR最優反應體系，即10 μL反應體系中，含有1.5 μL 10～20 ng/μL模板DNA，0.4 μL 25 mmol/L Mg2+，0.5 μL 2 mmol/L dNTPs，各0.15 μL 20 μmol/L正反向引物，0.1 μL 5 U/μL rTaq酶和1 μL 10×loading buffer。通過穩定性檢驗，證明該反應體系穩定、可靠，為今后SSR在桑樹領域更廣泛的應用提供了相應支持。

PCR反應體系中各組分的濃度會對擴增效果產生影響。Mg2+濃度過低時，會降低DNA聚合酶的活性;Mg2+濃度過高時，會降低擴增的特異性。dNTPs濃度過低時，產物條帶模糊不清;dNTPs濃度過高時時，會出現非特異性擴增。引物用量過少時，產物量過低;用量過多時，會產生非特異性產物和引物二聚體。DNA聚合酶的用量直接決定PCR反應的結果，用量過高時，容易產生非特異性擴增產物;用量過低時，則會導致目的條帶合成量減少。模板DNA濃度也會影響擴增效果，在彭波等的研究中，模板濃度達到了2.5 ng/μL[3-4]，而本試驗結果表明，模板DNA的量并非越大，擴增效果越好，在設定的4個濃度中，前2個濃度1.0、1.5 ng/μL的擴增效果較后2個濃度的好。羅義維等的研究表明，模板DNA的濃度與本研究結果相當，可見適當降低模板的濃度能得到相對清晰的條帶[2，6]。在本研究得到的最佳反應體系中，每個因素的濃度與羅義維等的研究結果[2]相比，除了模板DNA的濃度差異不大外，其余4個因素的濃度均低于后者，出現這種現象的原因可能是研究方法、目的、試驗材料、引物、技術要求不同造成的。

除了以上5種因素會影響PCR擴增效果外，引物退火溫度也是1個關鍵因素。退火溫度過高時，模板與引物退火反應緩慢而不準確;退火溫度過低時，則會產生引物二聚體和雜帶[16]。不同引物的退火溫度需要摸索才能確定，本研究只優化篩選了引物Mulstr-l的退火溫度，為56.6 ℃。當采用多個引物同時擴增時，反應程序可采用降落PCR方法。降落PCR能夠避免或有效降低由反應體系內主要組分濃度過高或過低、引物序列較短、退火溫度過高或過低、模板DNA復雜等因素引起的非特異性產物的產生[17]，并且省去了摸索引物退火溫度的繁瑣步驟，從而大大縮短了試驗時間。

綜上所述，在SSR-PCR擴增中，應綜合考慮各反應組分的濃度和引物退火溫度，才能得到有效的擴增條帶，從而增強結果的真實性。

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