產朊假絲酵母固體菌劑對水體生物絮團形成和氮磷去除率的影響

周鳳鳴 繆禮鴻 劉蒲臨

摘要：氮磷含量超標是導致水體富營養化的主要原因，向水體中投加有機碳源能促進生物絮團的形成并凈化水質。以產朊假絲酵母固體菌劑為研究對象，探究其對生物絮團的形成、氨氮與總磷去除效果的影響。結果表明，以膨化玉米粉作為固態載體吸附產朊假絲酵母去除氨氮和總磷效果最佳;在試驗水體中投加10 mg/L活性產朊假絲酵母固體菌劑與10 μL/L活性菌液，均有明顯降低水中氨氮、總磷含量的作用，其中投加活性固體菌劑效果最明顯，光照培養9 d后其氨氮與總磷的去除率分別為50.49%和38.24%，比空白對照組提高了67.63%和55.51%。通過相差顯微鏡觀察得出，投加固體菌劑后，在水體中能形成明顯的生物絮團結構，原生動物與原生藻類數量明顯增加。比較室內、室外2種培養條件下試驗結果表明，室外培養條件下投加固體菌劑水樣氨氮和總磷去除率分別為69.52%和 53.69%，較空白對照組提高了17.99%和30.57%;室內培養條件下，投加固體菌劑水樣氨氮和總磷去除率分別為 55.37% 和42.79%，較空白對照組提高了51.00%和41.13%。在人工接種銅綠微囊藻的水體中投加固體菌劑培養 10 d 后，銅綠微囊藻的生長受到明顯抑制，氨氮與總磷去除率分別達98.70%與40.48%，表明向水體中投加產朊假絲酵母固體菌劑具有調控水體生物群落的作用并能提高對氨氮和總磷的去除率。

關鍵詞：產朊假絲酵母;固體菌劑;生物絮團;氨氮;總磷;銅綠微囊藻

中圖分類號：X172 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0295-05

水產高密度養殖系統中存在的高污染、高發病率問題已經成為制約養殖業健康發展的關鍵因素。生物絮團技術的發展為上述問題的解決提供了新的方法[1-2]。生物絮團是由水體中的細菌、藻類、浮游動植物與有機碎屑等經過生物絮凝而成的具有自我繁殖能力的團聚物[3]，這種團狀物質能在凈化水質的同時為水產養殖動物提供優質生物餌料等[4-6]。有研究表明，向水體中投加一定量的碳源能促進生物絮團的形成，常用的碳源有葡萄糖、蔗糖、稻殼、麥麩、玉米粉等，載體的選擇應綜合考慮碳源的費用、生物降解率以及載體分散性[7]。陳海兵將稻殼粉與益生菌混合添加到養殖水體中，不僅降低了養殖成本，而且有助于異養微生物有效吸收降解水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮等有害物質并維持養殖水體的穩定性[8]。葉建勇等研究發現，投加甘蔗渣懸浮顆粒和芽孢桿菌能有效促進水體中生物絮團的形成，提高氨氮、亞硝態氮等有害物質的降解量，有效改善水質[9]。

筆者所在實驗室前期研究表明，投加產朊假絲酵母（Candida utilis）液態菌劑能夠較好地去除水體中氨氮與總磷[10]。本研究將產朊假絲酵母與有機固體載體相結合，探究其投入水體后對生物絮團形成和氮磷去除率的影響，以期為人工調控養殖水體微生物群落和富營養化水體的生物修復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與材料 產朊假絲酵母SG607，由筆者所在實驗室分離并保存。銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）905，購自中國科學院水生生物研究所藻種保藏中心。藻種經活化后于光照度為2 000 lx、光—暗周期為14 h—10 h的 25 ℃ 人工氣候箱中培養。膨化玉米粉等固體載體均為市購。

1.1.2 培養基 產朊假絲酵母采用醇母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培養基[11]和氨基酸廢液培養基[12]培養，銅綠微囊藻采用BG11培養基[13]培養。

1.1.3 試驗水樣 以取自湖北省武漢市某中心公園的景觀池塘水作為本試驗用的天然水樣。為比較投加菌液與固體菌劑對水中氨氮含量影響，模擬配制天然加富水樣，即在天然水樣中補加 8.0 mg/L NH4Cl和0.6 mg/L NaH2PO4。

1.2 試驗方法

1.2.1 產朊假絲酵母菌液及固體菌劑制備 將保存的產朊假絲酵母SG607菌株接種到YPD培養基平板上，30 ℃活化培養 2 d，取經活化的菌種接入YPD液體培養基中，于30 ℃、170 r/min條件下培養20 h后，轉接到氨基酸廢液培養基中，于30 ℃、170 r/min條件下培養18 h，制備成酵母菌液;將菌液與固體載體按質量比1 ∶ 2混合均勻后，制備成固體菌劑，備用。

1.2.2 不同產朊假絲酵母固體菌劑對水樣中氨氮與總磷去除率的影響 取2 mg不同載體的固體菌劑分別加入到盛有200 mL天然加富水樣的三角瓶中，以不進行任何處理的水樣為空白對照，以加入 2 μL 菌液的水樣為菌液空白對照，于人工氣候箱中光照培養7 d后，測定其氨氮、總磷質量濃度，每個處理3次重復。

1.2.3 活性產朊假絲酵母及滅活產朊假絲酵母對水樣中生物絮團形成及氨氮、總磷去除率的影響 取2 μL活性菌液、2 mg 活性固體菌劑分別加入到盛有200 mL天然加富水樣的三角瓶中，以添加等量的無菌水、滅活菌液、膨化玉米粉、滅活固體菌劑作為對照，于人工氣候箱中光照培養9 d，測定細菌活菌數及氨氮、總磷質量濃度，并使用熒光相差顯微鏡觀察拍照，每個處理3次重復。

1.2.4 室內外不同培養條件下產朊假絲酵母菌劑對氨氮與總磷去除率的影響 室內培養在人工氣候箱中進行，分別取2 μL菌液、2 mg固體菌劑加入到盛有200 mL天然加富水樣的三角瓶中培養，空白對照瓶中添加2 μL無菌水。室外試驗在60 cm×30 cm×50 cm的塑料箱中進行，分別取650 μL菌液、650 mg固體菌劑投加至裝有65 L天然加富水樣的長方形塑料箱中，空白對照組中加入650 μL無菌水，連續培養13 d后，測定水中細菌活菌數與氨氮、總磷質量濃度，每個處理3次重復。

1.2.5 產朊假絲酵母SG607菌液及固體菌劑對天然加富水樣中銅綠微囊藻生長的影響 在200 mL天然加富水樣中接入藻細胞濃度為1.15×107 CFU/mL的銅綠微囊藻2 mL，然后分別加入2 μL菌液、2 mg固體菌劑，對照組采用2 μL無菌水、2 μL無菌載體分別替代2 μL菌液、2 mg固體菌劑，在光照培養箱中培養10 d，取樣測定藻細胞數及氨氮、總磷質量濃度。每個處理3次重復。

1.2.6 藻細胞數、細菌總數、氨氮質量濃度和總磷質量濃度的測定 藻細胞數的測定采用血球計數板計數法，測定3次取平均值;水中細菌總數的測定采用牛肉膏平板涂布法;藻液經0.45 μm微孔濾膜過濾后測定濾液中氨氮、總磷質量濃度，氨氮質量濃度的測定采用苯酚次氯酸鹽法，總磷質量濃度的測定采用鉬酸銨分光光度法，本研究涉及所有水體常規理化指標的測定參照《水和廢水監測分析方法》（第四版）[14]。

1.2.7 試驗時間與地點 室外水樣試驗于2016年9月8—30日在湖北省武漢市東西湖區常青公園進行，當時氣溫范圍為20～32 ℃;室內水樣試驗于2016年5—10月在武漢輕工大學資源與環境微生物實驗室人工培養氣候箱中完成。

2 結果與分析

2.1 不同載體吸附產朊假絲酵母對水樣氨氮與總磷去除率的影響

為研究不同載體吸附產朊假絲酵母SG607對水中氨氮與總磷去除率的影響，分別將不同載體及其吸附后的固體菌劑投加至天然加富水樣（水質參數見表1）中，光照培養1周后比較水樣中氮磷含量。結果（圖1）表明，相較于空白對照組，投加載體和固體菌劑的處理均具有一定降解氨氮與總磷的效果，其中投加固體菌劑的處理效果更好，且不同載體吸附產朊假絲酵母降解氨氮與總磷效果有明顯差異，其中膨化大米和膨化玉米粉吸附產朊假絲酵母投入天然加富水樣后的氨氮與總磷去除率較高，其氨氮去除率分別為46.7%和44.4%，分別較空白對照高179.64%和165.87%;總磷去除率分別為35.2%和37.5%，分別較空白對照高225.93%和247.22%。綜合考慮，后續試驗均選用膨化玉米粉為載體。

2.2 產朊假絲酵母固體菌劑對生物絮團形成及氨氮、總磷去除率的影響

各處理水樣的顯微觀察結果（圖2）顯示，與對照（圖2-a）相比，添加固體載體及其固體菌劑的水樣中均能觀察到少量原生動物和絲狀藻類。投加菌液的水樣中藻類長勢良好、生物絮團結構明顯且在藻類周邊能觀察到少量酵母細胞（圖2-e）。投加載體、滅活固體菌劑與固體菌劑的水樣中均觀察到黑色固體顆粒（圖2-b、圖2-d、圖2-f），其中投加 10 mg/L 固體活性菌劑的水樣中生物絮團形成良好，且該水樣中的藻類、原生動物最豐富（圖2-f），氨氮及總磷去除率最高分別達50.49%和38.24%（圖3），與空白對照相比其氨氮和總磷的除率分別提高了67.63%和55.51%，與投加滅活固體菌劑的對照相比其氨氮與總磷去除率分別提高了21.45%和19.69%。

2.3 不同培養條件對產朊假絲酵母固體菌劑去除氨氮及總磷的影響

將產朊假絲酵母菌液與固體菌劑分別加入天然加富水樣中，比較在室內和室外2種不同條件下對氨氮和總磷的去除效果。結果（圖4）表明，室外空白對照組氨氮與總磷去除率（分別為58.92%和41.12%）均高于室內空白對照組（分別為36.67%和30.32%）;室外培養條件下，投加固體菌劑水樣氨氮及總磷去除率分別為69.52%和53.69%，較投加菌液水樣分別提高了9.98%和11.37%，比空白水樣提高了 17.99% 和30.57%。室內培養條件下，投加固體菌劑水樣氨氮、總磷去除率分別為55.37%、42.79%，較投加菌液水樣去除率提高了11.72%、16.63%，比空白提高了51.00%、41.13%。

在2種不同的培養條件下，投加固體菌劑的水樣中細菌活菌數均高于投加菌液（圖5），室外培養時投加固體菌劑水樣的細菌活菌數最高為7.2×103 CFU/mL，比投加菌液與空白水樣分別增加了14.29%、46.94%;室內培養13 d時投加固體菌劑細菌活菌數為4.2×103 CFU/mL，比較投加菌液與空白水樣增加了68%和320%，且室內水樣細菌活菌數在第8天達到最高峰，而室外細菌活菌數在第13天仍呈增長趨勢，表明室外條件下細菌活菌數高于室內培養，環境中微生物對試驗水體中細菌活菌數有一定影響。

2.4 產朊假絲酵母SG607對天然加富水樣中銅綠微囊藻生長的影響

由圖6可知，在培養第6天時，各水樣中的銅綠微囊藻細胞數均達到最大值。添加菌液、載體及其固體菌劑后，銅綠微囊藻的生長均受到明顯抑制;添加固體菌劑后水樣中的銅綠微囊藻細胞數在培養第6天時高于加入載體水樣，但在第8天后均低于其他處理組。

如圖7所示，添加固體菌劑水樣氨氮去除率最高達 98.70%，與空白水樣相比提高38.96%，添加固體菌劑與投加菌液水樣中總磷去除率差異較小，最高分別為40.48%與 40.76%，與空白水樣相比分別提高了49.21%與50.24%。

3 討論

本研究比較測定了米糠、膨化玉米粉等不同含碳載體及其吸附產朊假絲酵母后制備的固體菌劑對水體中氨氮和總磷的去除率，得出膨化玉米粉作為載體吸附產朊假絲酵母的處理效果最佳。有研究表明，玉米經膨化加工后，淀粉被充分糊化，具有很好的水溶性[15]。膨化玉米粉比表面積大，具有較好的吸附性，投加到水中后分散性和懸浮性好，能為細菌、藻類、原生動物等微生物提供良好的附著基和有機碳源，有利于水體中的微生物生長和生物絮團的形成。

本研究表明，投加固體菌劑水樣中的氮磷去除效果明顯優于只投加載體或菌液的處理，其水樣中的細菌活菌數與原生動物數量均為最高。這可能是由于產朊假絲酵母菌劑具有促進水體中多種微生物生長的作用，使水體中有更多的氮磷營養元素被吸收轉化成微生物的生物量。Cai等研究表明，當藻類與酵母一起培養時，水中生物的多樣性與生物活性提高[16]。此外，人工投加碳源能在一定程度上促進生物絮團的形成和微生物群落結構的變化，從而降低水中氮磷含量[17-18]。

本研究結果表明，室外培養條件下投加固體菌劑及空白對照水體的氨氮及總磷去除率與細菌活菌數均明顯高于室內人工氣候箱中培養的水體。從試驗條件分析二者的區別主要在于光照、溫度和溶解氧含量。已有研究表明，隨著室外氣溫的升高，水體的溫度也逐漸升高，氨氮的降解系數逐漸增大[19-20]，且自然條件下光照與溶解氧更充足，水中耗氧與有機物分解速度快，更有利于水中浮游生物的生長和氮磷的吸收轉化[21]。

投加產朊假絲酵母固體菌劑與菌液均能在一定程度上抑制銅綠微囊藻的生長并降低水中氮磷含量，可能是由載體及酵母菌劑的添加促進了水體中其他原生藻類及異養細菌的生長，與銅綠微囊藻競爭營養所致。有研究表明，天然加富水體中原生藻類與銅綠微囊藻之間具有一定競爭關系，添加部分碳源后銅綠微囊藻可與異養微生物、原生動物等形成生物絮團，從而降低水中微囊藻生物量[22-24]。

4 結論

通過比較不同含碳載體及其吸附產朊假絲酵母后制備的固體菌劑對水體中氮磷去除率的影響，優選出以膨化玉米粉為載體制備的固體菌劑對水中氮磷去除率和生物絮團的形成效果最佳。

向天然加富水樣中投加活性固體菌劑和菌液，相比滅活試驗組均有明顯降低水中氨氮、總磷含量的作用，其中投加活性固體菌劑效果最明顯，通過相差顯微鏡觀察可知，投加固體菌劑、菌液與滅活固體菌劑處理組水樣中的生物絮團、原生藻類和原生動物的數量均有所增加。

在室內、室外培養條件下分別投加10 mg/L的固體菌劑培養14 d后，室外處理組水樣中氨氮與總磷去除率分別比室內處理組高25.56%和25.47%。室外培養條件下水中細菌總數一直處于增長階段并在培養第14天時達到最大值，為7.2×103 CFU/mL，而室內培養條件下細菌總數在第8天達到最高值后開始下降，最終細菌總數為4.2×103 CFU/mL。

在人工添加銅綠微囊藻的水樣中投加10 mg/L固體菌劑培養10 d后，銅綠微囊藻生長受到明顯抑制，氨氮與總磷去除率分別達98.70%與40.48%。

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