OsRhoGDI2過表達轉基因水稻的篩選鑒定及外源基因拷貝數的初步分析

杜京堯 尚飛 王高華

摘要：水稻Rho GDP解離抑制基因OsRhoGDI2是從幼穗中分離出的功能未知基因。為鑒定該基因的功能，筆者所在實驗室前期構建了植物過表達載體pCAMBIA1302-OsRhoGDI2-GFP，并對水稻進行了遺傳轉化。對OsRhoGDI2過表達轉基因水稻T2代進行篩選和鑒定，采用PCR技術鑒定轉基因植株，采用半定量RT-PCR和實時熒光定量PCR檢測OsRhoGDI2在轉基因水稻中的表達水平，結果顯示，其中6個株系為過表達轉基因植株，OsRhoGDI2表達水平上調1.69～13.35倍。為檢測外源基因在轉基因水稻中的拷貝數，分別以蔗糖磷酸合成酶基因SPS和潮霉素抗性基因HYG為內參基因和標記基因，采用實時熒光定量PCR（qPCR）技術結合內參基因和標記基因的標準曲線進行分析，結果顯示在所檢測的6個轉基因株系中，外源基因的拷貝數均為1，提示已經獲得穩定遺傳的OsRhoGDI2過表達轉基因水稻，為后續OsRhoGDI2基因的功能研究奠定基礎。

關鍵詞：OsRhoGDI2;轉基因水稻;表達分析;拷貝數;外源基因

中圖分類號： S511.03 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0050-04

植物Rho/Rac也稱為Rop（Rho of plant），是植物中唯一與信號轉導有關的小GTP結合蛋白，功能涉及細胞極性生長[1-3]、肌動蛋白細胞骨架重組[4-5]、次生壁形成[6]、分生組織信號傳遞[7]以及抗逆和激素應答[8-11]等。作為信號通路的分子開關，Rho蛋白通過與靶蛋白的相互作用，實現對細胞生理活動的調控和影響，已明確的一類相互作用蛋白是Rho GDP解離抑制因子（Rho GDP dissociation inhibitors，RhoGDIs），功能是調節Rho的胞內定位，通過阻止GTP與Rho的結合，抑制Rho的活化，因而是Rho的負調控因子[12-14]。但是目前對植物RhoGDIs研究的報道較少，雖有從擬南芥、煙草、水稻等植物中篩選到RhoGDIs的報道[15-17]，但是對其在植物生長發育等過程中生物學功能的研究非常有限。Carol等對擬南芥突變體scn1的研究發現，一種擬南芥的RhoGDI基因SCN1/AtrhoGDI1通過控制局部RHD2/AtrbohC NADPH氧化酶的激活，調控根毛細胞的生長[18];Wu等的研究發現，擬南芥AtRhoGDI1通過ROP信號通路，介導對幼苗和葉表皮細胞形態建成的調節，而且AtRhoGDI1被CPK3磷酸化是執行其功能的前提[19]，但是至今尚未見水稻RhoGDIs基因功能的報道。

水稻Rho GDP解離抑制基因OsRhoGDI2是通過酵母雙雜交篩選，從雌雄蕊形成期水稻幼穗中分離的功能未知基因。對該基因編碼蛋白的生物信息學分析和亞細胞定位檢測發現，該基因編碼蛋白在活細胞中廣泛分布[20]。對OsRhoGDI2基因啟動子轉基因功能鑒定的研究表明，該基因2 100 bp的上游調控序列即可以啟動GUS在穎花、花藥和花粉中的特異表達，該基因的表達受到生長素（IAA）等多種激素的脅迫和誘導[21]。為了進一步鑒定OsRhoGDI2的功能，本研究基于實驗室的前期工作，對OsRhoGDI2過表達轉基因水稻T2代進行篩選和鑒定，分別采用PCR、RT-PCR和qRT-PCR技術在DNA和RNA水平上進行檢測，并通過qPCR技術鑒定OsRhoGDI2在轉基因株系中的拷貝數，旨在為后續分析OsRhoGDI2基因的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 水稻粳稻品種日本晴（Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare），簡稱WT，由山東省農業科學院作物與分子育種實驗室提供;OsRhoGDI2過表達轉基因水稻，簡稱OE-OsRhoGDI2，由筆者所在實驗室前期構建，已篩選獲得T1代種子，遺傳背景為日本晴。

1.1.2 載體 植物過表達載體pCAMBIA1302-OsRhoGDI2-GFP由筆者所在實驗室前期構建。

1.1.3 主要試劑 總RNA提取試劑RNAiso Plus、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ購自寶生物工程（大連）有限公司，2×Es Taq MasterMix （Dye）購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.1.4 引物設計 本試驗所用引物（表1）均由蘇州金維智生物科技有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻取材 選取適量的對照（WT）水稻種子和OE-OsRhoGDI2水稻T1代種子，2016年5月1日播種于河南師范大學試驗園地（113.90°E、35.32°N）。水稻生長至 20 d （幼苗期）、90 d（抽穗期）時，分別取其植株葉片，液氮冷凍處理，-80 ℃ 保存備用。

1.2.2 OsRhoGDI2轉基因植株的篩選 取幼苗期水稻嫩葉，采用十六烷基三甲基三甲基溴化銨（CTAB）法提取基因組DNA。以F1/R1為引物，基因組DNA為模板進行PCR反應，按照2×Es Taq MasterMix說明書配制反應體系（10 μL）：2×Taq Master Mix 5.0 μL、F1（10 μmol/L）0.4 μL、R1（10 μmol/L）0.4 μL、基因組DNA 0.2 μL 和無菌水4.0 μL。PCR反應條件為94 ℃預變性 2 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環;72 ℃延伸2 min。擴增產物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 OsRhoGDI2基因在轉基因水稻中表達水平的檢測

1.2.3.1 總RNA的提取和cDNA的制備 取抽穗期水稻葉片，根據寶生物工程（大連）有限公司RNAiso Plus試劑說明書，分別提取對照（WT）水稻和OE-OsRhoGDI2水稻T2代幼苗葉片總RNA，然后按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）試劑盒說明書進行反轉錄，制備cDNA。

1.2.3.2 半定量RT-PCR 以“1.2.3.1”節獲得的cDNA為模板，按照PrimeSTAR HS DNA Polymerase說明書配制半定量RT-PCR反應體系（50 μL），其中內參基因UBQ的PCR擴增體系為5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+ Plus）10.0 μL、dNTP（2.5 mmol/L）4.0 μL、UBQ引物F2（10 μmol/L）1.0 μL、UBQ引物R2（10 μmol/L）1.0 μL、PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL、cDNA模板2.0 μL和無菌水31.5 μL。PCR反應條件為98 ℃變性30 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，30個循環。OsRhoGDI2的擴增體系引物采用F1/R1，其余同UBQ的PCR擴增體系。PCR反應退火溫度為58 ℃，其余參數同UBQ的PCR反應條件。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3.3 實時熒光定量PCR 取“1.2.3.1”節制備的cDNA為模板，以F3/R3為引物進行OsRhoGDI2的qRT-PCR反應，以水稻OsAct1基因為內參，按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書配制反應體系（20 μL）：2×SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL、PCR Forward primer（10 μmol/L）0.8 μL、PCR Reverse primer（10 μmol/L）0.8 μL、cDNA 2.0 μL、滅菌水 6.4 μL。采用2步法進行PCR擴增：第1步95 ℃預變性 30 s;第2步PCR反應95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，40個循環。

每組試驗做3次重復，利用Roche LightCycler 96自帶軟件LightCycler 96 v1.1進行數據分析，以2-ΔΔCT法[22]分析OsRhoGDI2基因表達水平。

1.2.4 OsRhoGDI2基因在轉基因水稻中拷貝數的鑒定 HYG基因標準曲線的制作參考楊立桃等的方法[23]，以含有HYG基因的pCAMBIA1302-OsRhoGDI2-GFP質粒DNA溶液（107、106、105、104、103拷貝/μL）為模板，以F5/R5為引物進行qPCR反應，按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書進行配制，反應體系同“1.2.3.3”節。采用2步法進行PCR擴增，進行45個循環，其余參數同“1.2.3.3”節。得到等梯度拷貝數對應的CT值。依據CT值與起始模板數的對數值之間的一定的線性關系來制作標準曲線。水稻內參基因SPS標準曲線的制作參考Ding等的方法[24]。

以6個陽性OE-OsRhoGDI2水稻基因組DNA為模板，分別以F5/R5和F6/R6為引物進行qPCR反應，按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書進行配制，反應體系同“1.2.3.3”節。采用2步法進行PCR擴增，進行45個循環，其余參數同“1.2.3.3”節。分別獲得6個植株HYG與SPS基因的CT值，并由HYG與SPS基因的相關性方程計算其起始模板數。用純合二倍體水稻SPS作為內參基因，將H0與S0的比值乘以2得到OsRhoGDI2基因在轉基因水稻中的拷貝數。

2 結果與分析

2.1 OsRhoGDI2轉基因水稻的篩選

以水稻基因組DNA為模板，用引物F1/R1進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定陽性轉基因植株。由于OsRhoGDI2轉基因表達載體內插入的目的基因長度為795 bp，所以從陽性轉基因水稻基因組DNA中能擴增出 795 bp 特異片段，而對照（WT）植株中不能擴增出該大小的條帶。電泳結果顯示，在檢測的15個樣品中，除了3、8、11號之外，都可以擴增得到預期大小的片段，且與陽性對照條帶位置一致（圖1），說明OsRhoGDI2基因已經整合到水稻基因組中。

2.2 OsRhoGDI2在轉基因水稻中表達水平的檢測

選取PCR檢測為陽性的轉基因水稻，提取葉片總RNA，采用半定量RT-PCR檢測該基因的表達水平，內參采用水稻泛素（UBQ）基因，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，在對照（WT）水稻葉片中，OsRhoGDI2基因的表達水平較低，而在所檢測的7株轉基因水稻中，OsRhoGDI2基因的表達水平均有不同程度的提高，尤其是7、9、10、12、16號這5株的表達量有顯著的增高（圖2），說明這5株水稻是OE-OsRhoGDI2陽性植株。

進一步采用實時定量PCR方法檢測OsRhoGDI2基因在轉基因水稻中的表達水平。由圖3可知，除2號外，在其余6株轉基因水稻中OsRhoGDI2基因的表達水平均比對照（WT）高，基因表達量極顯著上調的有6號（1.69倍）、16號（2.69倍）、10號（4.02倍）、12號（5.98倍）、9號（9.72倍）和7號（13.35倍），且與半定量RT-PCR檢測結果一致，證明OsRhoGDI2基因在這些轉基因水稻中實現了過量表達。

2.3 HYG基因標準曲線的制作

以含有HYG基因的pCAMBIA1302-OsRhoGDI2-GFP質粒DNA溶液（107、106、105、104、103拷貝/μL）為模板，基于qPCR數據獲得了HYG基因的標準曲線（圖4），其相關系數 r=0.999 7，說明相關性高。其CT值與起始模板數（H0）之間的相關性方程為：H0=10（-0.297CT+12.356）。

2.4 OsRhoGDI2在轉基因水稻中拷貝數的測定

以上述鑒定的6株陽性OE-OsRhoGDI2水稻基因組DNA為模板，分別以F5/R5和F6/R6引物組合，對HYG基因與SPS基因進行qPCR，獲得擴增曲線與待測樣品的CT值（表2），并由HYG與SPS基因的相關性方程計算其起始模板數。

OsRhoGDI2基因在轉基因水稻中的拷貝數的計算結果顯示，對照水稻拷貝數為0，其余有6個OE-OsRhoGDI2水稻拷貝數均為1（表3）。

3 結論與討論

植物遺傳轉化是農作物改良和基因功能研究的常用試驗方法。本研究在實驗室前期工作的基礎上，對OsRhoGDI2轉基因水稻T2代進行了篩選和鑒定，獲得6個陽性轉基因水稻株系。現有的研究認為，過表達后代中外源基因拷貝數是影響目的基因表達水平和遺傳穩定性的主要因素。據統計分析顯示，外源基因拷貝數為1或2時能夠穩定遺傳高表達，而外源基因拷貝數過多（達4～5）往往使外源基因不表達甚至導致基因沉默[25-26]。因此在獲得陽性過表達轉基因植株后，對其外源基因拷貝數進行鑒定分析是必要的。

本研究對外源基因拷貝數的檢測所采用的內參基因為水稻特有的單拷貝基因SPS[24]，轉基因植株的標志基因是植物表達載體的標志基因HYG，也是轉基因植物篩選常用的標志。檢測結果顯示，OsRhoGDI2在過表達轉基因水稻中均為單拷貝，提示基因能夠穩定遺傳和表達，這與筆者所在實驗室對其T1代和T2代的連續篩選結果是一致的，陽性率均在85%以上。

本研究采用基因組DNA擴增的方法，首先檢測了OsRhoGDI2過表達植物載體是否穩定整合到水稻基因組中，進而采用半定量RT-PCR、實時熒光定量PCR技術在轉錄水平檢測了OsRhoGDI2在轉基因水稻中的表達水平，并通過外源基因拷貝數的測算，證實外源OsRhoGDI2基因整合到水稻基因組中的拷貝數均為1。本研究篩選和鑒定了6個獨立的OsRhoGDI2過表達轉基因株系，為后續以這些材料開展對OsRhoGDI2的功能鑒定奠定了良好的基礎。

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