2種姜屬植物組培快繁體系的優(yōu)化

李昕洋 吳丹 熊武建

摘要：分別以光果姜塊莖幼芽、珊瑚姜組培苗莖尖為外植體，通過組織培養(yǎng)方式進(jìn)行芽誘導(dǎo)、芽增殖，以篩選出合適的培養(yǎng)基。結(jié)果表明，光果姜適宜的增殖培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 5.0 mg/L+TDZ 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+瓊脂0.7%+蔗糖3%，此時叢生芽增殖系數(shù)相對最大，為3.44，芽增殖時期在20 d左右，平均每株新生幼苗株高為 1.53 cm，新葉展開數(shù)為1.80張，且均能自然生根;珊瑚姜增殖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方為MS+TDZ 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+瓊脂0.7%+蔗糖3%，此時芽增殖系數(shù)為5.47，較佳配方為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+瓊脂0.7%+蔗糖3%，此時芽增殖系數(shù)為4.47，2個配方芽增殖誘導(dǎo)率均達(dá)到100%，外植體褐化死亡率均為0%。

關(guān)鍵詞：光果姜;珊瑚姜;快繁體系;生長調(diào)節(jié)劑;培養(yǎng)基

中圖分類號： S632.504+.3 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0054-05

姜科植物分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，兼具藥用和觀賞價值，是開發(fā)新型花卉品種的重要資源。目前，姜科花卉在南方地區(qū)已形成一定規(guī)模，并從國內(nèi)外引種了一些品種，但很多品種都沒有進(jìn)行大量開發(fā)利用。若想推動其產(chǎn)業(yè)發(fā)展，加快繁殖是當(dāng)前必須要解決的問題[1]。

姜科植物通常采用分切根狀莖這種常規(guī)技術(shù)進(jìn)行繁殖，繁苗速度慢，且生產(chǎn)規(guī)模難以擴(kuò)大。組織培養(yǎng)快繁技術(shù)是植物短期內(nèi)進(jìn)行大量繁殖的有效途徑，采用莖尖、腋芽、幼莖、幼小的花序軸作為外植體[2]，在優(yōu)化組織培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上進(jìn)行組織培養(yǎng)，能夠提高植物的再生效率[3]，實現(xiàn)姜科種苗的大量繁殖。本研究以光果姜（Zingiber nudicarpum）和珊瑚姜（Z. corallinum）為材料，建立、優(yōu)化光果姜、珊瑚姜組織培養(yǎng)快速繁殖體系，以提高芽增殖誘導(dǎo)率，降低外植體褐化死亡率，縮短培養(yǎng)周期，為光果姜和珊瑚姜的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定良好的基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

光果姜引種自海南吊羅山，其帶芽塊莖采集于華南師范大學(xué)生物園內(nèi);珊瑚姜引種自廣東陽春，其莖尖采集于廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室前期誘導(dǎo)出的組培苗。6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、苯基噻二唑基脲（TDZ）、萘乙酸（NAA），市購。芽增殖所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS+瓊脂0.7%+蔗糖3%。

1.2 試驗方法

1.2.1 光果姜組培快繁體系的優(yōu)化

1.2.1.1 外植體的獲得 采挖光果姜帶芽塊莖，放入滴有洗潔精的清水中浸泡;用細(xì)毛刷將粘連的泥土清洗干凈，用蒸餾水沖洗8～10次，在無菌操作臺上用70%乙醇、0.1%氯化汞溶液消毒;用無菌水沖洗5次，再用滅菌濾紙吸干表面水分，即獲得無菌外植體。

1.2.1.2 芽的誘導(dǎo) 將獲得的無菌外植體接種在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L上，3個月后即得到無菌幼苗（圖1）。為儲備足夠的無菌苗用于后續(xù)芽增殖試驗，30 d繼代1次，連續(xù)繼代2～3次。

1.2.1.3 不定芽的增殖 待光果姜無菌苗長至約5 cm時，切下莖基部約0.5 cm，接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同生長調(diào)節(jié)劑組合的芽增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，每個處理接種30個芽，重復(fù)3次。選取6-BA、 TDZ、NAA這3種生長調(diào)節(jié)劑，其組合采用L16（34）正交設(shè)計（表1）。6-BA濃度分別為0、2、3、5 mg/L，TDZ濃度分別為0、0.2、0.4、1.0 mg/L，NAA濃度分別為0、0.5、1.0、2.0 mg/L。每5 d統(tǒng)計1次芽的增殖情況，40 d時調(diào)查統(tǒng)計叢生芽的株高、新葉展開數(shù)等情況。

1.2.2 珊瑚姜組培快繁體系的優(yōu)化 在前期試驗的基礎(chǔ)上，選取生長健壯的珊瑚姜組培苗，將其葉片及根系適當(dāng)修剪，留取約1.0 cm的莖尖作為外植體，分別接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同生長調(diào)節(jié)劑組合的芽增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，每個處理接種4瓶，重復(fù)2次。生長調(diào)節(jié)劑組合設(shè)計見表2、表3，6-BA 濃度分別為1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L，TDZ濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L，NAA濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L。培養(yǎng)40 d后調(diào)查統(tǒng)計試驗結(jié)果。

1.3 組織培養(yǎng)條件

光源為熒光燈，光照時間為16 h/d，光照度為 40 μmol/（m2·s），培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃。

1.4 統(tǒng)計方法

在試驗調(diào)查的基礎(chǔ)上，統(tǒng)計芽增殖系數(shù)、增殖誘導(dǎo)率、褐化死亡率，計算公式如下：

增殖系數(shù)=誘導(dǎo)產(chǎn)生芽的總數(shù)/接種外植體的總數(shù);

增殖誘導(dǎo)率=（誘導(dǎo)生芽的外植體數(shù)/接種外植體總 數(shù)）×100%;

褐化死亡率=（褐化死亡的外植體數(shù)/接種外植體的總數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 光果姜組培快繁體系的優(yōu)化

2.1.1 光果姜芽的誘導(dǎo) 由圖2可見，無菌苗接種后10 d左右，外植體開始膨大，15 d開始有芽點形成，之后每10 d左右展開1張新葉，35 d時每個外植體都基本產(chǎn)生新芽，有些已形成幼苗。

2.1.2 不同生長調(diào)節(jié)劑及其濃度組合對光果姜芽增殖的影響

2.1.2.1 TDZ、NAA使用濃度相對固定 由表1可見，TDZ、NAA使用濃度均為0 mg/L，分別單獨使用6-BA濃度為2、3、5 mg/L時，光果姜芽增殖系數(shù)分別為2.06±0.32、2.37±0.39、2.57±0.31，隨6-BA使用濃度的增加，增殖系數(shù)略呈提高的趨勢，且相互間差異不顯著;隨著6-BA使用濃度的增加，幼苗株高及新葉展開數(shù)呈先減小后增加的趨勢;芽增殖集中時間較6-BA濃度為0 mg/L（CK）時略有縮短。當(dāng)TDZ、NAA使用濃度分別為0.2、0.5 mg/L固定不變，6-BA濃度分別為2、3、5 mg/L時，光果姜芽增殖系數(shù)分別為 3.00±0.50、3.12±0.36、3.44±0.31，隨6-BA使用濃度的增加，增殖系數(shù)也略呈提高趨勢，且相互間差異不顯著，芽增殖集中時間分別為25、25、20 d，略有縮短，株高、新葉展開數(shù)相互間差異不顯著。當(dāng)TDZ、NAA使用濃度分別為0.4、1.0 mg/L 固定不變，6-BA濃度分別為2、3、5 mg/L時，光果姜芽增殖系數(shù)分別為2.25±0.37、3.37±0.37、2.44±0.40，隨6-BA使用濃度的增加，增殖系數(shù)呈先升高后下降趨勢，相互間差異不顯著，芽增殖集中時間分別為35、20、20 d，有明顯縮短。當(dāng)TDZ、NAA使用濃度分別為1.0、2.0 mg/L固定不變，6-BA濃度分別為2、3、5 mg/L時，光果姜芽增殖系數(shù)分別為2.00±0.33、2.64±0.34、1.40±0.24，隨6-BA使用濃度的增加，增殖系數(shù)呈先升高后下降趨勢，相互間差異不顯著，芽增殖集中時間分別為25、25、20 d，略有縮短。可見，6-BA 在2.0～5.0 mg/L單獨作用時，隨使用濃度的增大，對光果姜芽的增殖有促進(jìn)作用，但并不明顯;TDZ、NAA處于較低水平時，隨6-BA濃度的增加，芽增殖系數(shù)整體呈升高趨勢，但TDZ、NAA處于較高水平時，芽增殖系數(shù)表現(xiàn)出先升高后下降的現(xiàn)象，即當(dāng)6-BA濃度為3.0 mg/L時，芽增殖系數(shù)相對最大，且TDZ、NAA低水平下配合使用6-BA對光果姜芽有較好的增殖效果;隨6-BA使用濃度的增加，芽集中增殖所用時間總體在縮短，6-BA濃度為5.0 mg/L時芽集中增殖時間多在20 d左右。

2.1.2.2 6-BA使用濃度相對固定 由表1可見，在6-BA使用濃度均為0 mg/L，不同濃度TDZ、NAA共同作用下，3個處理的光果姜芽增殖系數(shù)、株高及葉片展開數(shù)相互間差異不顯著，芽增殖時間也基本一致，為30～35 d;6-BA濃度分別為2.0、3.0 mg/L時，各處理光果姜芽的增殖系數(shù)相互間差異不顯著;6-BA濃度為5.0 mg/L，TDZ、NAA使用濃度分別為1.0、2.0 mg/L時的芽增殖系數(shù)較TDZ、NAA使用濃度分別為0.2、0.5 mg/L時的有顯著降低。

2.1.2.3 3種生長調(diào)節(jié)劑綜合使用 由表1可見， 培養(yǎng)基中不使用生長調(diào)節(jié)劑時，光果姜株高和新葉展開數(shù)顯著高于其他處理。

2.2 珊瑚姜組培快繁體系的優(yōu)化

2.2.1 芽的增殖 由圖3可見，接種后7 d，大多數(shù)外植體開始有側(cè)芽萌動，15 d左右展開第1張新葉，20 d左右單個幼芽基本可以長成完整的植株幼苗，約30 d可形成叢生芽，且生根率達(dá)100%。

2.2.2 6-BA+NAA組合對珊瑚姜芽增殖誘導(dǎo)的影響 由表2可見，NAA使用濃度為0 mg/L、單獨使用不同濃度6-BA時，均可誘導(dǎo)珊瑚姜芽的增殖，其中以6-BA濃度為 2.0 mg/L 時誘導(dǎo)增殖效果相對最好，增殖系數(shù)為3.16±1.76，顯著高于不使用生長調(diào)節(jié)劑的處理（P

6-BA與NAA組合使用時，當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L時，隨NAA濃度的增加，芽增殖誘導(dǎo)率、增殖系數(shù)呈先上升后下降的趨勢，NAA濃度為0.5 mg/L時芽增殖誘導(dǎo)率、芽增殖系數(shù)相對最大，分別為100.00%、4.13;當(dāng)6-BA濃度為 2.0 mg/L 時，隨NAA濃度的增加，芽增殖系數(shù)、芽增殖誘導(dǎo)率逐漸降低，以NAA濃度為0.1 mg/L時芽增殖誘導(dǎo)率、芽增殖系數(shù)相對最大，分別為100.00%、4.47;當(dāng)6-BA濃度為 3.0 mg/L 時，隨NAA濃度的增加，芽增殖誘導(dǎo)率整體呈先下降后上升的趨勢，芽增殖系數(shù)呈波浪形變化，其中，以NAA濃度為 1.0 mg/L 時珊瑚姜芽的增殖誘導(dǎo)率、增殖系數(shù)相對最大，分別為90.63%、3.34;當(dāng)6-BA濃度為5.0 mg/L時，隨NAA濃度的增加，芽增殖誘導(dǎo)率整體呈先下降后上升的趨勢，芽增殖系數(shù)呈先減小后增大的趨勢。

2.2.3 TDZ+NAA組合對珊瑚姜芽增殖誘導(dǎo)的影響 由表3可見，NAA使用濃度為0 mg/L、單獨使用不同濃度TDZ時，均可誘導(dǎo)珊瑚姜芽的增殖，其中以TDZ濃度為0.5 mg/L時芽增殖系數(shù)較高，為2.59;當(dāng)TDZ濃度超過0.5 mg/L時，芽增殖誘導(dǎo)率逐漸下降，芽增殖系數(shù)逐漸減小;隨著TDZ濃度的升高，珊瑚姜芽的褐化死亡率逐漸提高，TDZ濃度為 2.0 mg/L 時相對最大，褐化死亡率為12.50%。

TDZ與NAA組合使用時，當(dāng)TDZ濃度為0.1 mg/L時，隨NAA濃度的增加，芽增殖誘導(dǎo)率有所下降但不明顯，芽增殖系數(shù)呈先增大后減小的趨勢，NAA濃度為0.5 mg/L時，芽增殖誘導(dǎo)率、芽增殖系數(shù)相對最大，分別為100.00%、5.47;當(dāng)TDZ濃度為0.5 mg/L時，隨NAA濃度的增加，珊瑚姜芽增殖誘導(dǎo)率逐漸降低，芽增殖系數(shù)減小，NAA濃度為0.1 mg/L時，芽增殖誘導(dǎo)率、芽增殖系數(shù)相對最大，分別為100.00%、4.66;當(dāng)TDZ濃度為1.0 mg/L時，隨NAA濃度的增加，芽增殖誘導(dǎo)率整體呈下降趨勢，芽增殖系數(shù)呈先增大后減小趨勢，NAA濃度為0.5 mg/L時，芽增殖誘導(dǎo)率、芽增殖系數(shù)相對最大，分別為93.75%、3.38;當(dāng)TDZ濃度為2.0 mg/L時，隨NAA濃度的增加，芽增殖誘導(dǎo)率基本無變化，芽增殖系數(shù)逐漸增大，NAA濃度為1.0 mg/L時芽增殖誘導(dǎo)率、芽增殖系數(shù)相對最大，分別為87.50%、3.25。

綜上可見，TDZ濃度為0.1 mg/L、NAA濃度為0.5 mg/L配合使用時，珊瑚姜芽的增殖誘導(dǎo)率相對最好，芽增殖系數(shù)也相對最大，分別為100.00%、5.47，可作為珊瑚姜芽增殖培養(yǎng)基中最佳的生長調(diào)節(jié)劑組合，其次為6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，珊瑚姜芽的增殖誘導(dǎo)率、芽增殖系數(shù)可分別達(dá)到100.00%、4.47。

3 結(jié)論與討論

植物生長調(diào)節(jié)劑是組培快繁的重要影響因子，不同種類的植物生長調(diào)節(jié)劑對外植體生長分化的作用效果不同，同種植物生長調(diào)節(jié)劑不同濃度的作用效果也存在差異，因此，不同植物生長調(diào)節(jié)劑的合適配比是外植體快速繁殖體系建立的關(guān)鍵。在植物不定芽的誘導(dǎo)增殖研究中，添加的生長調(diào)節(jié)劑主要為6-BA、NAA、TDZ等，TDZ具有很強的分裂素活性，6-BA是性價比較高的細(xì)胞分裂素，熱穩(wěn)定性較好。細(xì)胞分裂素的生理作用主要是引起細(xì)胞分裂、分化，以及誘導(dǎo)芽的形成，促進(jìn)芽的生長[4-5]。

有研究發(fā)現(xiàn)，生長素在低濃度時可促進(jìn)生長，濃度高時則抑制生長，如果濃度更高則會使植物受傷[6-7];在芽誘導(dǎo)增殖過程中，高濃度TDZ會使外植體褐化死亡率提高[8-10]。本研究結(jié)果表明，光果姜適宜的生長調(diào)節(jié)劑組合為6-BA 5.0 mg/L+TDZ 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L，相應(yīng)叢生芽增殖系數(shù)相對最大，為3.44，芽增殖時期在20 d左右，平均每株新生幼苗株高為1.53 cm，新葉展開數(shù)為1.80張，珊瑚姜增殖誘導(dǎo)的最佳生長調(diào)節(jié)劑組合為TDZ 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L，相應(yīng)芽增殖系數(shù)為5.47，較佳組合為6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，芽增殖系數(shù)為4.47，合適的6-BA、TDZ濃度可有利于促進(jìn)芽增殖誘導(dǎo)，加入一定濃度的NAA能進(jìn)一步提高其增殖系數(shù)，與戴水蓮等的研究結(jié)果[11]一致，這可能與NAA促進(jìn)芽的生長和生根，有利于充分吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)[12];如繼續(xù)提高6-BA、TDZ濃度反而會使芽增殖誘導(dǎo)率降低，高濃度細(xì)胞分裂素反而會抑制芽的增殖誘導(dǎo)。

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