2種姜屬植物組培快繁體系的優化

李昕洋 吳丹 熊武建

摘要：分別以光果姜塊莖幼芽、珊瑚姜組培苗莖尖為外植體，通過組織培養方式進行芽誘導、芽增殖，以篩選出合適的培養基。結果表明，光果姜適宜的增殖培養基配方為MS+6-BA 5.0 mg/L+TDZ 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+瓊脂0.7%+蔗糖3%，此時叢生芽增殖系數相對最大，為3.44，芽增殖時期在20 d左右，平均每株新生幼苗株高為 1.53 cm，新葉展開數為1.80張，且均能自然生根;珊瑚姜增殖誘導的最佳培養基配方為MS+TDZ 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+瓊脂0.7%+蔗糖3%，此時芽增殖系數為5.47，較佳配方為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+瓊脂0.7%+蔗糖3%，此時芽增殖系數為4.47，2個配方芽增殖誘導率均達到100%，外植體褐化死亡率均為0%。

關鍵詞：光果姜;珊瑚姜;快繁體系;生長調節劑;培養基

中圖分類號： S632.504+.3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）14-0054-05

姜科植物分布于熱帶及亞熱帶地區，兼具藥用和觀賞價值，是開發新型花卉品種的重要資源。目前，姜科花卉在南方地區已形成一定規模，并從國內外引種了一些品種，但很多品種都沒有進行大量開發利用。若想推動其產業發展，加快繁殖是當前必須要解決的問題[1]。

姜科植物通常采用分切根狀莖這種常規技術進行繁殖，繁苗速度慢，且生產規模難以擴大。組織培養快繁技術是植物短期內進行大量繁殖的有效途徑，采用莖尖、腋芽、幼莖、幼小的花序軸作為外植體[2]，在優化組織培養體系的基礎上進行組織培養，能夠提高植物的再生效率[3]，實現姜科種苗的大量繁殖。本研究以光果姜（Zingiber nudicarpum）和珊瑚姜（Z. corallinum）為材料，建立、優化光果姜、珊瑚姜組織培養快速繁殖體系，以提高芽增殖誘導率，降低外植體褐化死亡率，縮短培養周期，為光果姜和珊瑚姜的進一步開發利用奠定良好的基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

光果姜引種自海南吊羅山，其帶芽塊莖采集于華南師范大學生物園內;珊瑚姜引種自廣東陽春，其莖尖采集于廣東省植物發育生物工程重點實驗室前期誘導出的組培苗。6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、苯基噻二唑基脲（TDZ）、萘乙酸（NAA），市購。芽增殖所用基礎培養基為MS+瓊脂0.7%+蔗糖3%。

1.2 試驗方法

1.2.1 光果姜組培快繁體系的優化

1.2.1.1 外植體的獲得 采挖光果姜帶芽塊莖，放入滴有洗潔精的清水中浸泡;用細毛刷將粘連的泥土清洗干凈，用蒸餾水沖洗8～10次，在無菌操作臺上用70%乙醇、0.1%氯化汞溶液消毒;用無菌水沖洗5次，再用滅菌濾紙吸干表面水分，即獲得無菌外植體。

1.2.1.2 芽的誘導 將獲得的無菌外植體接種在芽誘導培養基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L上，3個月后即得到無菌幼苗（圖1）。為儲備足夠的無菌苗用于后續芽增殖試驗，30 d繼代1次，連續繼代2～3次。

1.2.1.3 不定芽的增殖 待光果姜無菌苗長至約5 cm時，切下莖基部約0.5 cm，接入基礎培養基中添加不同生長調節劑組合的芽增殖培養基上進行培養，每個處理接種30個芽，重復3次。選取6-BA、 TDZ、NAA這3種生長調節劑，其組合采用L16（34）正交設計（表1）。6-BA濃度分別為0、2、3、5 mg/L，TDZ濃度分別為0、0.2、0.4、1.0 mg/L，NAA濃度分別為0、0.5、1.0、2.0 mg/L。每5 d統計1次芽的增殖情況，40 d時調查統計叢生芽的株高、新葉展開數等情況。

1.2.2 珊瑚姜組培快繁體系的優化 在前期試驗的基礎上，選取生長健壯的珊瑚姜組培苗，將其葉片及根系適當修剪，留取約1.0 cm的莖尖作為外植體，分別接種到基礎培養基中添加不同生長調節劑組合的芽增殖培養基上進行培養，每個處理接種4瓶，重復2次。生長調節劑組合設計見表2、表3，6-BA 濃度分別為1.0、2.0、3.0、5.0 mg/L，TDZ濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L，NAA濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L。培養40 d后調查統計試驗結果。

1.3 組織培養條件

光源為熒光燈，光照時間為16 h/d，光照度為 40 μmol/（m2·s），培養溫度為（25±2） ℃。

1.4 統計方法

在試驗調查的基礎上，統計芽增殖系數、增殖誘導率、褐化死亡率，計算公式如下：

增殖系數=誘導產生芽的總數/接種外植體的總數;

增殖誘導率=（誘導生芽的外植體數/接種外植體總 數）×100%;

褐化死亡率=（褐化死亡的外植體數/接種外植體的總數）×100%。

2 結果與分析

2.1 光果姜組培快繁體系的優化

2.1.1 光果姜芽的誘導 由圖2可見，無菌苗接種后10 d左右，外植體開始膨大，15 d開始有芽點形成，之后每10 d左右展開1張新葉，35 d時每個外植體都基本產生新芽，有些已形成幼苗。

2.1.2 不同生長調節劑及其濃度組合對光果姜芽增殖的影響

2.1.2.1 TDZ、NAA使用濃度相對固定 由表1可見，TDZ、NAA使用濃度均為0 mg/L，分別單獨使用6-BA濃度為2、3、5 mg/L時，光果姜芽增殖系數分別為2.06±0.32、2.37±0.39、2.57±0.31，隨6-BA使用濃度的增加，增殖系數略呈提高的趨勢，且相互間差異不顯著;隨著6-BA使用濃度的增加，幼苗株高及新葉展開數呈先減小后增加的趨勢;芽增殖集中時間較6-BA濃度為0 mg/L（CK）時略有縮短。當TDZ、NAA使用濃度分別為0.2、0.5 mg/L固定不變，6-BA濃度分別為2、3、5 mg/L時，光果姜芽增殖系數分別為 3.00±0.50、3.12±0.36、3.44±0.31，隨6-BA使用濃度的增加，增殖系數也略呈提高趨勢，且相互間差異不顯著，芽增殖集中時間分別為25、25、20 d，略有縮短，株高、新葉展開數相互間差異不顯著。當TDZ、NAA使用濃度分別為0.4、1.0 mg/L 固定不變，6-BA濃度分別為2、3、5 mg/L時，光果姜芽增殖系數分別為2.25±0.37、3.37±0.37、2.44±0.40，隨6-BA使用濃度的增加，增殖系數呈先升高后下降趨勢，相互間差異不顯著，芽增殖集中時間分別為35、20、20 d，有明顯縮短。當TDZ、NAA使用濃度分別為1.0、2.0 mg/L固定不變，6-BA濃度分別為2、3、5 mg/L時，光果姜芽增殖系數分別為2.00±0.33、2.64±0.34、1.40±0.24，隨6-BA使用濃度的增加，增殖系數呈先升高后下降趨勢，相互間差異不顯著，芽增殖集中時間分別為25、25、20 d，略有縮短?？梢?，6-BA 在2.0～5.0 mg/L單獨作用時，隨使用濃度的增大，對光果姜芽的增殖有促進作用，但并不明顯;TDZ、NAA處于較低水平時，隨6-BA濃度的增加，芽增殖系數整體呈升高趨勢，但TDZ、NAA處于較高水平時，芽增殖系數表現出先升高后下降的現象，即當6-BA濃度為3.0 mg/L時，芽增殖系數相對最大，且TDZ、NAA低水平下配合使用6-BA對光果姜芽有較好的增殖效果;隨6-BA使用濃度的增加，芽集中增殖所用時間總體在縮短，6-BA濃度為5.0 mg/L時芽集中增殖時間多在20 d左右。

2.1.2.2 6-BA使用濃度相對固定 由表1可見，在6-BA使用濃度均為0 mg/L，不同濃度TDZ、NAA共同作用下，3個處理的光果姜芽增殖系數、株高及葉片展開數相互間差異不顯著，芽增殖時間也基本一致，為30～35 d;6-BA濃度分別為2.0、3.0 mg/L時，各處理光果姜芽的增殖系數相互間差異不顯著;6-BA濃度為5.0 mg/L，TDZ、NAA使用濃度分別為1.0、2.0 mg/L時的芽增殖系數較TDZ、NAA使用濃度分別為0.2、0.5 mg/L時的有顯著降低。

2.1.2.3 3種生長調節劑綜合使用 由表1可見， 培養基中不使用生長調節劑時，光果姜株高和新葉展開數顯著高于其他處理。

2.2 珊瑚姜組培快繁體系的優化

2.2.1 芽的增殖 由圖3可見，接種后7 d，大多數外植體開始有側芽萌動，15 d左右展開第1張新葉，20 d左右單個幼芽基本可以長成完整的植株幼苗，約30 d可形成叢生芽，且生根率達100%。

2.2.2 6-BA+NAA組合對珊瑚姜芽增殖誘導的影響 由表2可見，NAA使用濃度為0 mg/L、單獨使用不同濃度6-BA時，均可誘導珊瑚姜芽的增殖，其中以6-BA濃度為 2.0 mg/L 時誘導增殖效果相對最好，增殖系數為3.16±1.76，顯著高于不使用生長調節劑的處理（P

6-BA與NAA組合使用時，當6-BA濃度為1.0 mg/L時，隨NAA濃度的增加，芽增殖誘導率、增殖系數呈先上升后下降的趨勢，NAA濃度為0.5 mg/L時芽增殖誘導率、芽增殖系數相對最大，分別為100.00%、4.13;當6-BA濃度為 2.0 mg/L 時，隨NAA濃度的增加，芽增殖系數、芽增殖誘導率逐漸降低，以NAA濃度為0.1 mg/L時芽增殖誘導率、芽增殖系數相對最大，分別為100.00%、4.47;當6-BA濃度為 3.0 mg/L 時，隨NAA濃度的增加，芽增殖誘導率整體呈先下降后上升的趨勢，芽增殖系數呈波浪形變化，其中，以NAA濃度為 1.0 mg/L 時珊瑚姜芽的增殖誘導率、增殖系數相對最大，分別為90.63%、3.34;當6-BA濃度為5.0 mg/L時，隨NAA濃度的增加，芽增殖誘導率整體呈先下降后上升的趨勢，芽增殖系數呈先減小后增大的趨勢。

2.2.3 TDZ+NAA組合對珊瑚姜芽增殖誘導的影響 由表3可見，NAA使用濃度為0 mg/L、單獨使用不同濃度TDZ時，均可誘導珊瑚姜芽的增殖，其中以TDZ濃度為0.5 mg/L時芽增殖系數較高，為2.59;當TDZ濃度超過0.5 mg/L時，芽增殖誘導率逐漸下降，芽增殖系數逐漸減小;隨著TDZ濃度的升高，珊瑚姜芽的褐化死亡率逐漸提高，TDZ濃度為 2.0 mg/L 時相對最大，褐化死亡率為12.50%。

TDZ與NAA組合使用時，當TDZ濃度為0.1 mg/L時，隨NAA濃度的增加，芽增殖誘導率有所下降但不明顯，芽增殖系數呈先增大后減小的趨勢，NAA濃度為0.5 mg/L時，芽增殖誘導率、芽增殖系數相對最大，分別為100.00%、5.47;當TDZ濃度為0.5 mg/L時，隨NAA濃度的增加，珊瑚姜芽增殖誘導率逐漸降低，芽增殖系數減小，NAA濃度為0.1 mg/L時，芽增殖誘導率、芽增殖系數相對最大，分別為100.00%、4.66;當TDZ濃度為1.0 mg/L時，隨NAA濃度的增加，芽增殖誘導率整體呈下降趨勢，芽增殖系數呈先增大后減小趨勢，NAA濃度為0.5 mg/L時，芽增殖誘導率、芽增殖系數相對最大，分別為93.75%、3.38;當TDZ濃度為2.0 mg/L時，隨NAA濃度的增加，芽增殖誘導率基本無變化，芽增殖系數逐漸增大，NAA濃度為1.0 mg/L時芽增殖誘導率、芽增殖系數相對最大，分別為87.50%、3.25。

綜上可見，TDZ濃度為0.1 mg/L、NAA濃度為0.5 mg/L配合使用時，珊瑚姜芽的增殖誘導率相對最好，芽增殖系數也相對最大，分別為100.00%、5.47，可作為珊瑚姜芽增殖培養基中最佳的生長調節劑組合，其次為6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，珊瑚姜芽的增殖誘導率、芽增殖系數可分別達到100.00%、4.47。

3 結論與討論

植物生長調節劑是組培快繁的重要影響因子，不同種類的植物生長調節劑對外植體生長分化的作用效果不同，同種植物生長調節劑不同濃度的作用效果也存在差異，因此，不同植物生長調節劑的合適配比是外植體快速繁殖體系建立的關鍵。在植物不定芽的誘導增殖研究中，添加的生長調節劑主要為6-BA、NAA、TDZ等，TDZ具有很強的分裂素活性，6-BA是性價比較高的細胞分裂素，熱穩定性較好。細胞分裂素的生理作用主要是引起細胞分裂、分化，以及誘導芽的形成，促進芽的生長[4-5]。

有研究發現，生長素在低濃度時可促進生長，濃度高時則抑制生長，如果濃度更高則會使植物受傷[6-7];在芽誘導增殖過程中，高濃度TDZ會使外植體褐化死亡率提高[8-10]。本研究結果表明，光果姜適宜的生長調節劑組合為6-BA 5.0 mg/L+TDZ 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L，相應叢生芽增殖系數相對最大，為3.44，芽增殖時期在20 d左右，平均每株新生幼苗株高為1.53 cm，新葉展開數為1.80張，珊瑚姜增殖誘導的最佳生長調節劑組合為TDZ 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L，相應芽增殖系數為5.47，較佳組合為6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，芽增殖系數為4.47，合適的6-BA、TDZ濃度可有利于促進芽增殖誘導，加入一定濃度的NAA能進一步提高其增殖系數，與戴水蓮等的研究結果[11]一致，這可能與NAA促進芽的生長和生根，有利于充分吸收培養基中的營養物質有關[12];如繼續提高6-BA、TDZ濃度反而會使芽增殖誘導率降低，高濃度細胞分裂素反而會抑制芽的增殖誘導。

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