去甲腎上腺素在抑郁狀態下提高乳腺癌的惡性程度

歐陽雪巖，朱 朕，楊 超，王 麗，丁 罡,4，姜 峰

(1. 上海交通大學醫學院，上海 200025；2. 上海大學生命科學學院，上海 200444；3. 上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院癌痛轉化研究所，上海 202150；4. 上海國際醫學中心，上海 201318)

乳腺癌在女性中發病率最高，且乳腺癌患者更易罹患心理疾病[1]。抑郁癥作為世界第四大常見疾病，被認為是影響乳腺癌預后的一個獨立危險因素[2]。有臨床研究顯示，存在抑郁癥狀的癌癥患者預后較差[3]。因此，本研究從臨床現象出發，利用體內實驗和體外實驗，探究抑郁對乳腺癌惡性程度的影響，以期加強臨床治療過程中對腫瘤患者情緒管理的重視程度。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1一般資料 選取上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院2018年1月～2018年12月收治的乳腺癌患者116例，女性，年齡40～65歲。所有病例均由病理學及臨床診斷確診。

1.1.2研究方法 采用問卷調查法對腫瘤患者心理狀況進行評價分析，并與國內常模進行比較[4]，評定時間為腫瘤患者近1周的心理狀況。在患者簽署知情同意書后方可進行。

1.1.3評價工具 對入選的腫瘤患者采用Zung編制的抑郁自評量表(SDS)進行評測[4]，SDS量表采用1～4級評分，共20個項目，總分80分。標準分等于總評分乘以1.25。SDS標準分<53為無抑郁組，53～62分為輕度抑郁組，63～72分為中度抑郁組，>73分為重度抑郁組。

1.1.4統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件對收集數據進行統計分析。評定結果以%表示。與國內常模進行比較分析，采用獨立結果t檢驗。

1.2 慢性輕度不可預測性應激模型(chronic unpredictable mild stress model, CUMS)

1.2.1實驗動物 該部分實驗所有小鼠分為兩組，每組包含10只♀ C57BL/6小鼠，體質量20～25 g，購自上海捷斯杰實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2018-0004，用于CUMS模型的構建。動物實驗按照上海交通大學醫學院動物護理與使用委員會批準的方案進行。

1.2.2造模方案 造模方案參考Jaggi等[5]已發表文獻，并在此基礎上稍作調整。將小鼠置于明暗12 h∶12 h的循環中(早上7點開燈)，室溫25 ℃，小鼠可自由地獲得水和食物。將小鼠隨機分為對照組或實驗組(n=10)。實驗組暴露于不可預見的應激源下，對照組則不經歷應激。實驗組應激刺激具體過程見Tab 1。在這些應激刺激之后，使用行為學檢測(曠場實驗、強迫游泳實驗和蔗糖偏好實驗)來確認動物是否具有明顯的抑郁癥狀。

1.2.3小鼠皮下荷瘤模型 參考謝貴林等[6]利用C57BL/6小鼠皮下接種乳腺癌細胞構建小鼠荷瘤模型的方法及經驗，在造模成功后，對所有動物進行皮下接種乳腺癌細胞。接種乳腺癌細胞之前，首先將小鼠置于X射線下照射4 h，注射免疫抑制劑環磷酰胺35 mg·kg-1，降低其免疫功能。小鼠皮下注射懸浮在0.2 mL PBS中的MCF-7細胞(1×107)。兩周后處死小鼠，剝離腫瘤，計算腫瘤體積：腫瘤體積=(a×b2)/2，其中a為最大表面直徑，b為最小表面直徑，并收集所有動物的血清。

Tab 1 CUMS model procedure

1.3 ELISA法檢測去甲腎上腺素水平在模型建立結束時，收集來自對照組和實驗組動物的血液。將收集的樣品在室溫下靜置40 min，然后3 000 r·min-1、4 ℃離心10 min。吸出300 μL血清，加入等體積的HCl后，1 000 r·min-1、4 ℃離心10 min。使用ELISA試劑盒(江蘇酶免實業有限公司)檢測血清中的去甲腎上腺素。每個樣品測定3次，并且基于標準曲線計算每個樣品的平均OD值。該實驗過程獨立重復3次。

1.4 細胞培養人乳腺癌細胞系MCF-7，購自上海生命科學研究院和中國科學院細胞庫。細胞在DMEM培養基中培養，添加1%雙抗和10%熱滅活的胎牛血清(Thermo Fisher Scientific)，在37 ℃、5% CO2的環境中培養。

1.5 免疫熒光染色將MCF-7細胞以2×104個細胞的密度加入6孔板中，蓋上蓋玻片24 h后，用預冷的PBS洗滌3次，使用4%多聚甲醛固定細胞，用0.15% Triton透化，然后PBS再次充分洗滌。將細胞與腎上腺素β1受體(β1-adrenergic receptor，β1-AR)、腎上腺素β2受體(β2-adrenergic receptor，β2-AR)(美國Abcam公司)或基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2，MMP-2) (碧云天生物科技)的一抗(1∶100)在室溫下孵育1 h。然后，將細胞與二抗(1∶1 000)在室溫條件下避光孵育1 h。再次用PBS洗滌，用DAPI(生工生物工程股份有限公司)對細胞進行復染，并用熒光顯微鏡(日本Olympus公司)觀察。

1.6 細胞增殖測定使用CCK-8(Life Technologies)評估細胞活力。將細胞接種于96孔板(每孔1×103個，100 μL)中，將去甲腎上腺素(0、0.1、1、10、100 μmol·L-1)加入孔中，在37 ℃、5% CO2下培養24、48、72 h。向每個孔中加入10 μL CCK-8，溫育2 h后，使用Multiskan FC酶免疫測定分析儀(Thermo Fisher Scientific)檢測450 nm處的吸光度(OD)。使用對照孔中未處理細胞的吸光度讀數進行對比，以獲得細胞存活百分比。該實驗重復3次。

1.7 細胞遷移實驗使用劃痕實驗確定細胞遷移能力。將MCF-7細胞以每孔2×104個細胞的密度接種到6孔板中，并在無血清的培養基中培養過夜，將細胞分為加入10 μmol·L-1去甲腎上腺素(Sigma公司)組；20 μmol·L-1普萘洛爾(Sigma公司)處理組以及對照組。繼續培養24 h后，每孔用PBS洗滌3次。在顯微鏡下選取視野觀察。

1.8 細胞侵襲測定將MCF-7細胞(3×103個)置于上部Transwell小室(24孔板，0.8 μm孔徑，Corning Costar公司)上，小室內底面涂抹覆蓋Matrigel(Sigma公司)，并加入200 μL無血清的培養液。下室加入500 μL含有10%胎牛血清的DMEM，分為普萘洛爾預處理并加去甲腎上腺素組、10 μmol·L-1去甲腎上腺素組、普萘洛爾組、對照組。在37 ℃溫育24 h后，用棉簽輕擦上層小室內底面的細胞，用4%多聚甲醛固定下膜表面的細胞，用0.1%結晶紫染色，并在顯微鏡下計數(Leica公司)。 獨立進行3次實驗并比較結果。

1.9 細胞周期測定將MCF-7細胞按處理方法分為4組：去甲腎上腺素(10 μmol·L-1)、去甲腎上腺素與普萘洛爾同時處理、或普萘洛爾單獨處理或不經過處理。然后使用胰蛋白酶消化，離心收集細胞，預冷PBS洗滌2次，4 ℃下在冷凍的70%乙醇中固定過夜。收集固定的細胞，用PBS洗滌2次，懸浮于含有10 mg·L-1碘化丙啶(PI，美國Sigma公司)和100 mg·L-1RNase A的PBS中， 4 ℃避光孵育至少30 min。使用流式細胞儀(Becton-Dickinson FACScan)測定細胞周期分布。

1.10 蛋白提取和蛋白質印跡用含有蛋白酶抑制劑PMSF的200 μL RIPA裂解液裂解MCF-7細胞，收集總蛋白。使用BCA蛋白質測定法測定提取的蛋白質濃度。蛋白上樣量30 μg，SDS-PAGE電泳后，轉移到PVDF膜上。膜5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育2 h，然后用Trident ECL(碧云天生物科技)顯色。

2 結果

2.1 乳腺癌患者的抑郁評估結果對116例乳腺癌患者抑郁的發生率評估結果顯示(Fig 1)，48%乳腺癌患者伴有抑郁癥狀(56/116)，超過國內常模的抑郁發生率。其中輕度抑郁24人，中度抑郁21人，重度抑郁11人。從評分來看，乳腺癌患者SDS的評分為(65.0±3.2)，高于國內常模的評分(42±11)。

Fig 1 High incidence of depressive symptoms in breast cancer patients

2.2 小鼠血清中的去甲腎上腺素濃度與抑郁程度存在正相關為了確定應激模型組與對照組血清之間去甲腎上腺素的差異，對收集的血清樣本進行了ELISA檢測。Fig 2結果表明，CUMS模型組小鼠血清中的去甲腎上腺素水平較對照組明顯升高。經統計分析，造模組小鼠的去甲腎上腺素水平與抑郁程度呈正相關。以上結果提示，抑郁可以促進動物血清去甲腎上腺素水平的提高。

2.3 抑郁癥狀可以促進乳腺癌的進展如Fig 3所示，在經過不可預見性應激刺激以后，CUMS模型組小鼠的腫瘤體積(2 797±126)mm3,與對照組小鼠腫瘤體積(1 943±224)mm3差異有顯著性。表明抑郁作為一個獨立因素，可以促進乳腺癌的發展。

2.4 人乳腺癌MCF-7細胞中存在β-ARs的表達為了研究去甲腎上腺素是否直接影響乳腺癌的發展，檢測了MCF-7細胞中是否存在β-ARs的表達。Fig 4A的Western blot結果顯示，β1-AR和β2-AR均在MCF-7細胞中表達。另外，免疫熒光實驗支持這一結果(Fig 4B)。

Fig 2 Serum norepinephrine levels in CUMS model and its relationship with depression severity n=10)

Fig 3 Development of breast cancer promoted by depressive symptoms n=10)

Fig 4 Expression of β-adrenalin receptors in human breast cancer cells n=3)

2.5 去甲腎上腺素可以增強MCF-7細胞的惡性程度，這種增強作用可以被β受體阻滯劑普萘洛爾減弱首先，CCK-8檢測結果表明，去甲腎上腺素可劑量依賴性地促進MCF-7細胞的增殖(Fig 5)。Transwell實驗檢測了MCF-7乳腺癌細胞的侵襲能力，且免疫熒光實驗證明經去甲腎上腺素處理后，MMP-2的水平升高，表明去甲腎上腺素可以使腫瘤細胞的侵襲能力增強，而這種增強作用可被普萘洛爾抑制(Fig 6)。在劃痕實驗中(Fig 7)，觀察到去甲腎上腺素對細胞的遷移發揮促進作用，并且這種促進作用可被普萘洛爾明顯消除。以上結果表明，去甲腎上腺素可以增加乳腺癌的惡性程度。

Fig 5 Proliferation of MCF-7 cells promoted by norepinephrine n=3)

2.6 去甲腎上腺素促進細胞周期從G期向S期轉變為了確定去甲腎上腺素對細胞周期的影響，使用流式細胞儀確定去甲腎上腺素是否會影響DNA合成。如Fig 8所示，去甲腎上腺素可以導致S期細胞積累的增加，G期細胞的積累減少，而用普萘洛爾預處理后，促進細胞從G期轉變為S期的作用降低。由于DNA的合成發生在S期，因此，可以認為去甲腎上腺素可以促進DNA合成,但這種促進作用差異無顯著性。

2.7 去甲腎上腺素通過p38 MAPK通路刺激MCF-7細胞增殖、遷移和侵襲為了探明去甲腎上腺素通過何種途徑促進MCF-7細胞的增殖、遷移和侵襲，使用Western blot檢測了p38 MAPK通路的激活。Fig 9結果表明，去甲腎上腺素處理后，p-p38 MAPK表達量增加，且普萘洛爾可以削弱這一作用，各組p38 MAPK表達則沒有差異。因此推測，β-AR的激活可能會提高p38 MAPK信號通路的磷酸化程度。

Fig 6 Invasive ability of MCF-7 cells increased by norepinephrine

3 討論

有研究證實，30%～70%的腫瘤患者伴有不同程度的抑郁癥狀[7]。本研究發現，乳腺癌患者中抑郁癥狀的發生率高于國內常模。為了更好地揭示抑郁對腫瘤是否存在促進作用，我們采用了CUMS模型來模擬臨床慢性抑郁，對小鼠皮下荷瘤后的一系列實驗結果證實，抑郁一定程度上促進乳腺癌的發展進程。Chang等[8]的研究與本研究涉及的實驗相似，且實驗結果一致。研究發現，動物血清中抑郁相關激素，即去甲腎上腺素含量明顯上升。針對這一結果，我們在細胞層面上進行一系列實驗，證實去甲腎上腺素可以促進乳腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲。研究發現，在黑色素瘤[9]、卵巢癌[10]以及前列腺癌[11]中的相關類似結果。

Fig 7 Migration ability of MCF-7 cells increased by norepinephrine

信號通路方面的相關研究指出，Akt[12]、mTOR[13]可能作為抑郁影響腫瘤的信號通路。本研究證實，p38 MAPK信號通路的特殊性[14-15]，因此可能在抑郁促進乳腺癌進程中發揮重要作用。因此，血清去甲腎上腺素可以作為判斷乳腺癌患者抑郁程度的一項指標，提示及時關注患者心理狀態，采取積極的處理措施，降低抑郁情緒對乳腺癌的不良影響。然而，在本研究臨床部分的研究中，考慮到腫瘤患者疾病進程的特殊性，填寫問卷易加重患者的心理負擔，與我們研究主旨相悖，因此本研究臨床樣本量不夠大，未來的研究會立足患者角度，適當擴大樣本量進行補充研究。

綜上所述，心理問題持續存在于乳腺癌的發病、診斷和治療過程中，不同程度地影響著患者的預后。現有抗腫瘤治療的理念不斷進步及醫療技術的持續更新，可能均無法減少患者經歷心理問題帶來的持續折磨。心理問題是與治療過程中的技術性問題無關的獨立存在。我們提倡對于存在抑郁癥狀的乳腺癌患者進行及時的、有針對性的心理干預，本質上是對于乳腺癌完整治療策略的一種補充。重視乳腺癌患者抑郁癥狀的臨床表現，提高乳腺癌患者抗腫瘤治療的有效性，無疑將為乳腺癌治療提供新的思路，這在臨床抗腫瘤治療過程中具有十分重要的現實意義。

Fig 8 Results of cell circle experiments n=3) *P<0.05 vs control group

Fig 9 Expression of p-p38 in MCF-7 cells promoted by norepinephrine

(致謝：本實驗完成于上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院新華癌痛轉化研究所，在此特別感謝于瑞華、倪祖琴、姚愛玉、程志軍等實驗室同仁的大力幫助。)