周氏克金巖方對Lewis肺癌小鼠凝血功能的影響

陳美娟，蔣日磊，胡 澄，程子昱，路悅陽，李祺瑞，顧 玲，李紅曉，張 旭

(南京中醫藥大學醫學與生命科學學院，江蘇 南京 210023)

腫瘤轉移是臨床上導致癌癥病人死亡的主要原因。腫瘤轉移的關鍵調節信號來源于癌細胞和腫瘤微環境細胞分子之間的相互作用，包括腫瘤相關的成纖維細胞、免疫細胞及內皮細胞等。其中，腫瘤細胞與血小板的相互作用既存在于腫瘤微環境，也存在于血液環境或腹水中，對腫瘤的生長和轉移至關重要[1]。臨床超過30%的惡性實體瘤病人中都存在血小板增多癥[2]。血小板數量和聚集程度的明顯提高不僅促進肺癌的血行轉移[3]，還是造成肺癌病人靜脈栓塞的重要原因[4-5]。“周氏克金巖方”(簡稱克方)為國醫大師周仲瑛教授的臨床肺癌治療驗方。前期研究表明，其具有較好的抑瘤作用，同時對小鼠生存期及生存質量具有明顯的改善作用[6]。本研究擬揭示該方對Lewis肺癌小鼠模型凝血功能的影響。

1 材料與方法

Tab 1 Effects of Ke formula on plasma coagulation parameters in Lewis lung cancer bearing mice

1.1 材料

1.1.1實驗動物及細胞株 清潔級C57BL/6小鼠36只，♂，體質量(18～22) g，由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供，許可證號：SCXK(蘇)2017-0001。飼養于南京中醫藥大學實驗動物中心，許可證號：SYXK(蘇)2014-0001。小鼠Lewis肺癌細胞(Lewis lung cancer cell line, LLC)，購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2藥物 周氏克金巖方(冬瓜子15 g、膽南星12 g、魚腥草15 g、金蕎麥15 g、山慈菇10 g、金銀花15 g、紅花10 g、蘇木10 g、半夏10 g、貓爪草15 g、南沙參12 g、麥冬12 g、玉竹12 g)，由南京中醫藥大學方劑學實驗室按常規方法煎制成浸膏，稀釋至所需濃度[7]。

1.1.3試劑 胎牛血清、RMPI 1640培養液，Gibco公司；凝血指標檢測試劑盒，均購自Sekisui Medical Co., LTD。

1.1.4儀器 CP3000全自動凝血分析儀(日本積水醫療科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 LLC細胞株使用含10%胎牛血清的RPMI 1640(青霉素100 kU·L-1、鏈霉素100 kU·L-1，pH 7.2)培養液，在5% CO2、37 ℃培養箱中培養。

1.2.2動物模型的建立 取6～8周的健康C57BL/6小鼠，25 ℃恒溫條件飼養。將體外培養至對數生長期的肺癌LLC細胞按1×1010·L-1的濃度，取0.2 mL注射入小鼠右上肢皮下，待瘤生長到3～5 mm，則造模成功，具體方法同文獻[6]。

1.2.3分組及給藥方法 造模成功小鼠進行隨機分組，分為正常組(Normal)、模型組(Model)、阿司匹林(19.5 mg·kg-1)組、周氏克金巖方低、中、高劑量(Ke 0.95、1.9、3.8 mg·kg-1)組，每組6只，灌胃給藥15 d。

1.2.4凝血指標檢測 將標本上全自動血凝儀檢測，采血后4 h內完成檢測。

1.2.5統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，組間兩兩比較用完全隨機設計的獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 周氏克金巖方對Lewis肺癌小鼠抗凝血相關指標的影響如Tab 1所示，相對于造模組，阿司匹林組明顯延長了活化部分凝血酶原時間(APTT)值(P<0.05)，同時給藥高劑量組也明顯延長了APTT時間(P<0.05)；相對于造模組，阿司匹林組明顯延長了造模后凝血酶時間(TT)水平(P<0.05)，給藥高劑量組同樣明顯延長了TT水平(P<0.05)。

2.2 周氏克金巖方對Lewis肺癌小鼠促凝血相關指標的影響如Tab 1所示，造模組明顯升高了纖維蛋白原(FIB)的水平(P<0.05)，而給藥中劑量組則明顯降低了FIB的水平(P<0.05)。

3 討論

本研究結果顯示，在接種Lewis肺癌移植瘤后，小鼠的抗凝血指標中凝血酶原時間(PT)及TT的值相對于正常組均有所降低，表現出高凝特征，阿司匹林給藥明顯延長了APTT及TT水平。同樣，在高劑量的周氏克金巖方給藥后，也明顯延長了APTT及TT的水平，顯示出該復方抗凝血的藥效作用。而對于促凝血指標，造模組FIB的水平相對于模型組明顯升高，而周氏克金巖方中劑量給藥組則明顯降低FIB的值。結果表明，周氏克金巖方中、高劑量給藥對于肺癌模型的高凝血特征有明顯的改善作用。