異綠原酸A抑制NLRP3炎性復合體/NF-κB活化減輕膠原誘導型關節炎大鼠炎癥反應

劉 楊，段學清，嚴福林，潘 春，吳繼春，曹 峰，梁 江

(貴州中醫藥大學 1. 基礎醫學院、2. 藥學院、3. 第一附屬醫院風濕免疫科，貴州 貴陽 550025)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)屬自身免疫病，以滑膜炎性增生為表現，易致關節腫脹，關節軟骨受損伴畸形，初期臨床治療多以積極抗炎治療，阻止患者關節骨質的破壞，降低致殘率。隨著對自身免疫性疾病治療藥物的深入研究和對作用靶點的挖掘，如白介素類單克隆抗體、信號通路靶向抑制類藥物、生物堿類、多糖類、黃酮類天然藥物等，已被開發并部分上市應用臨床[1]。異綠原酸A(isochlorogenic acid A)作為奎寧酸與咖啡酸酯化縮合下的天然產物，多存在于忍冬藤、黑骨藤、金銀花等植物中，具有一定的抗氧化、抗過敏、抗菌等作用[2]。但有關異綠原酸A對RA藥效和機制未有深入報道，本研究擬通過制備膠原誘導型關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型，考察異綠原酸A對類風濕關節炎動物模型干預后表現及其潛在抗炎分子機制，為異綠原酸A的開發應用提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SPF級SD大鼠，♂，體質量(200±20)g，購自長沙天勤生物技術有限公司，動物飼養合格證編號為43000200003443。

1.1.2藥物與試劑 異綠原酸A(純度99%)，購自成都德思特生物技術有限公司；白細胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)、腫瘤壞死因子ɑ(tumor necrosis factor ɑ，TNF-ɑ)、C反應蛋白(C reaction protein，CRP)、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)、白細胞介素18(interleukin 18，IL-18)試劑盒，均購自上海通蔚生物科技有限公司；NLRP3抗體(ab214185)、caspase-1抗體(ab1872)、NF-κB p65抗體(ab16502)、核因子κB活化因子受體配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)抗體(ab239607)、β-actin抗體(ab8226)，均購自Abcam公司；p-NF-κB p65抗體(#3031)、磷酸化核因子κB抑制蛋白ɑ(p-IκB-α)抗體(#2859)，均購自CST公司；完全弗氏佐劑，購自Sigma公司；牛Ⅱ型膠原，購自Chondrex公司；生物素標記山羊抗兔抗體、ECL發光液、蘇木精-伊紅染色試劑盒，均購自上海碧云天生物技術有限公司；MinuteTM動物細胞/組織總蛋白提取試劑盒，購自北京英文特生物技術有限公司；微量BCA蛋白定量試劑盒，購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.1.3儀器 石蠟病理切片機(浙江金華科迪儀器設備有限公司)；電泳儀、凝膠成像系統(Bio-Rad公司)；數顯百分測厚儀(河南華方信息技術有限公司)；電子顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)。

1.2 方法

1.2.1CIA大鼠模型的制備 SPF級SD大鼠隨機分為正常組10只和造模組若干只，根據參考文獻造模方式[3-4]，造模前，將膠原與完全弗氏佐劑1∶1混合成乳劑后冰上備用，造模組分別在d 0和d 7尾根部皮下多點注射乳劑0.2 mL，肉眼觀察大鼠足趾致炎情況，按評分標準進行模型篩選：0分為雙足跖趾無紅腫；1分為雙足跖趾輕度腫脹；2分為雙足跖趾中度腫脹；3分為雙足跖趾重度腫脹；4分為足跖趾、踝關節全部腫脹或伴有畸形。評分1分以上即可則隨機入組。制備模型成功的大鼠繼續隨機分配為模型組和異綠原酸A(50、100 mg·kg-1)組，每組10只。之后4組分別灌胃蒸餾水10 mL·kg-1和異綠原酸A 50或100 mg·kg-1，每天1次，連續給藥42 d。給藥期間動物無死亡，正常飲水飲食，符合貴州中醫藥大學動物倫理規范。動物稱重并測量每組大鼠足跖腫脹厚度后，處死取血；取骨關節，4%多聚甲醛固定；取關節滑膜組織，-80 ℃超低溫保存。

1.2.2足跖部腫脹度測量記錄 厚度測量儀測量大鼠雙后肢誘導前和誘導后每周腫脹度，記錄并統計分析。腫脹度=誘導后厚度-誘導前厚度。

1.2.3脾臟臟器系數檢測 解剖脾臟稱重，記錄并計算臟器系數：脾臟系數=脾臟重量÷大鼠體質量。

1.2.4HE染色觀察骨關節病理改變 骨關節組織常規脫鈣，脫鈣完全后自來水沖洗，70%、80%、90%、100%乙醇浸泡24 h，二甲苯浸泡12 h，液體石蠟浸泡12 h，包埋并切片，厚度10 μm，新鮮的二甲苯脫蠟20 min，100%、90%、80%、70%乙醇浸泡10 min，蒸餾水浸泡1 min，蘇木精染色10 min，自來水沖洗5 min，伊紅染色1 min，70%、90%乙醇浸泡10 min，二甲苯浸泡10 min，蓋玻片封片，鏡下觀察并記錄。

1.2.5免疫蛋白印跡法檢測關節滑膜內蛋白表達 根據試劑盒說明，提取關節滑膜總蛋白后，BCA法蛋白定量。按試劑盒操作步驟制備濃度12%分離膠和濃度5%濃縮膠，80 V電壓電泳2 h后，60 V電壓轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h后，加一抗β-actin(1∶6 000)、NLRP3(1∶300)、caspase-1(1∶2 500)，以及NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκB-ɑ、RANKL(1∶500)，4 ℃孵育過夜后，加入二抗(1∶10 000)，室溫孵育2 h，TBST沖洗3次，ECL顯影液顯影，分析結果。

1.2.6ELISA法檢測血漿IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、CRP、IFN-γ、IL-18水平 取大鼠血漿，3 000 r·min-1離心15 min，取上層并根據試劑盒要求，制定好標準曲線后，按試劑盒操作步驟進行。

1.2.7數據處理 采用SPSS 20.0統計學軟件對數據顯著性分析，組間比較采用F檢驗進行數據分析。

2 結果

2.1 異綠原酸A對大鼠足跖炎性腫脹度的影響Tab 1結果表明，與正常組比較，模型組大鼠足跖腫脹程度明顯增大(P<0.01)。異綠原酸A(50、100 mg·kg-1)組大鼠足跖腫脹程度明顯減輕，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2 異綠原酸A對大鼠脾臟系數的影響Fig 1結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠脾臟系數增加，差異具有統計學意義(P<0.05)。不同劑量異綠原酸A可降低模型大鼠的脾臟系數。

Fig 1 Effect of isochlorogenic acid A on spleen organ coefficient in rats n=10)

Tab 1 Effect of isochlorogenic acid A on swelling degree of voix pedis in rats at different time periods n=10)

2.3 異綠原酸A對大鼠骨關節病理的影響Fig 2的HE染色結果顯示，正常組骨關節面光滑，軟骨細胞排列整齊緊密，關節間隙良好，無贅生物生成。模型組骨關節面消失，軟骨細胞排列紊亂，關節間隙消失并融合。給予不同劑量的異綠原酸A可明顯抑制骨關節損傷的病理改變。

Fig 2 Effect of isochlorogenic acid A on pathology of bone and joint in rats by HE staining (scale bar=100 μm)

2.4 異綠原酸A對大鼠滑膜NLRP3、caspase-1、NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκB-α、RANKL蛋白表達的影響Fig 3結果顯示，與正常組相比，模型組NLRP3、caspase-1、NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκB-α、RANKL蛋白表達升高，差異具有統計學意義(P<0.01)。與模型組相比，不同劑量異綠原酸A可降低模型大鼠上述蛋白表達(P<0.01)。

2.5 異綠原酸A對血漿IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、CRP、IFN-γ、IL-18水平的影響Tab 2結果顯示，與正常組比較，模型組IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、CRP、IFN-γ、IL-18表達升高。與模型組比較，不同劑量異綠原酸A對血漿中IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、CRP、IFN-γ、IL-18表達均呈抑制作用，差異具有統計學意義(P<0.01)。

Fig 3 Effect of isochlorogenic acid A on expression of NLRP3, caspase-1, NF-κB p65, p-NF-κB p65, p-IκB-α, RANKL in rats synovium

3 討論

異綠原酸A是一種二咖啡酰奎寧酸類化合物，與綠原酸屬同分異構體，在中藥金銀花、忍冬藤、黑骨藤、菊花等天然植物含量較高。現已證實，異綠原酸A具有保肝抗炎、抗HBV、抑制大腸桿菌增殖等作用[5]。通過在大鼠體內經膠原誘導方式，構建和模擬RA模型分析后發現，膠原刺激后，模型組大鼠足跖部炎癥引發的腫脹度明顯增加，給予不同劑量的異綠原酸A后，模型大鼠足跖部炎癥腫脹程度被明顯抑制，表明異綠原酸A具有良好的抑炎藥理活性。對模型大鼠免疫器官脾臟進行稱重后發現，模型大鼠的脾臟經膠原誘導刺激后有明顯腫脹和臟器系數增加表現，給予異綠原酸A后可以改善這種表現，提示異綠原酸A可能對脾臟內免疫細胞的炎性增殖有抑制作用，這種可能需從脾臟內淋巴細胞增殖活性進行下一步的相關探討。

Tab 2 Effect of isochlorogenic acid A on plasma levels of IL-1β, IL-6, TNF-ɑ, CRP, IFN-γ and IL-18 in CIA rats , n=10)

RA作為自身免疫疾病，炎性反應的過度激活目前被認為是導致RA滑膜增生和骨質破壞的重要誘因。NLRP3炎性復合體與人類多種自身免疫病相關，在中性粒細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等免疫細胞中都有表達，它由NOD樣受體家族、凋亡相關斑點樣蛋白和caspase-1組成[6-7]。當NLRP3炎性復合體活化后，可剪切前體caspase-1蛋白變為caspase-1，后者進一步刺激IL-1β、IL-18等白介素家族細胞因子活化，而白介素家族蛋白現被證實在RA病程中有重要作用[8-9]。CIA模型大鼠關節滑膜檢測發現，異綠原酸A能明顯抑制NLRP3炎性復合體在關節滑膜內的表達，進而抑制血漿內白介素家族IL-1β、IL-18的過表達。NF-κB蛋白是目前研究炎癥的熱門靶點之一，在胞質中與NF-κB抑制蛋白結合，形成無活性聚合體。當炎癥信號產生時，胞質中NF-κB抑制蛋白被磷酸化，進一步被降解并釋放NF-κB蛋白進入胞核，增強靶基因的轉錄，增強炎性反應[10-11]。檢測CIA模型大鼠關節滑膜內NF-κB蛋白表達發現，異綠原酸A能明顯抑制關節滑膜內NF-κB蛋白表達及其磷酸化水平，并抑制NF-κB抑制蛋白ɑ亞基的磷酸化水平，進而抑制了相應炎性反應。

人破骨細胞與成骨細胞可調節骨骼生長發育，并使骨組織更新處于平衡狀態，維持正常的骨代謝。如果平衡被打破，破骨細胞多于成骨細胞，體內骨量降低，將難以維持骨骼的強度和彈性。TNF家族與NF-κB蛋白關系密切，RANKL屬于TNF家族成員，其主要作為破骨細胞表面上RANK受體，與相應配體結合，促進破骨細胞成熟和分化。TNF-α、甲狀旁腺激素等可促進RANKL過表達[12-14]。在RA患者體內，由增殖活化的T細胞和成纖維細胞等釋放IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、CRP等一系列因子，導致RANKL大量釋放，激活并促進破骨細胞分化與成熟，導致體內破骨細胞大量生長，成骨細胞減少，引發體內骨量丟失，繼而誘發關節骨組織缺損。CIA模型大鼠經異綠原酸A干預后，血漿IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、CRP、IFN-γ、IL-18均表達下調，炎癥級聯反應被明顯抑制，關節滑膜內的RANKL蛋白的過表達被明顯抑制，骨關節病理顯示，骨關節破壞征象明顯減輕，表明異綠原酸A可能抑制滑膜內RANKL蛋白和其他炎癥因子的表達，減輕CIA模型骨關節的損害程度。

綜上，本研究明確了異綠原酸A可抑制大鼠關節滑膜內NLRP3、caspase-1、NF-κB p65、RANKL蛋白過表達、降低p-IκB-ɑ和NF-κB p65蛋白的磷酸化水平，抑制血漿IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、CRP、IFN-γ、IL-18水平，進而減輕CIA大鼠的炎癥反應。