山楂葉總黃酮對膠質瘤U87細胞的抑制作用

刁婷婷，張雨晨，呂 偉，閔 清

(1. 湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100; 2. 湖北省咸寧市中心醫院藥學部，湖北 咸寧 437100)

人膠質母細胞瘤是一種Ⅳ級星形細胞瘤，是最常見、最具侵襲性的腦腫瘤[1]。膠質母細胞瘤在40～70歲之間發生率較高，中位生存期為診斷后的12～16個月。膠質母細胞瘤是腦腫瘤死亡率最高的腫瘤，雖然有手術、放療、化療、基因治療等多種治療方法, 但因其侵襲性強、復發率高、位置特殊、預后差, 具有很高的病死率和致殘率, 嚴重威脅著人類健康[2]。腫瘤細胞從原發腫瘤逃逸到轉移部位是一個多步驟的過程，需要細胞黏附的喪失，并獲得細胞的遷移和侵襲能力[3]。目前，治療惡性膠質瘤成為腫瘤領域的重大挑戰之一[4]，因此，尋找有效的生物靶點，研發理想的治療藥物尤為迫切。

山楂葉總黃酮(hawthorn leaves flavonoids，HLF)是一種存在山楂葉中的黃酮類化合物，山楂葉為薔薇科山楂屬植物山里紅或山楂的干燥葉[5]，由于其資源豐富、價格低廉，具有廣泛的藥理作用，且低毒安全的特性，近年來倍受醫藥研究者的關注。目前，從山楂葉中分離出的黃酮類化合物已有60余種，黃酮類化合物具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗癌防癌等功效[6]，具有重要的藥用價值，成為近年來研究熱點之一。現已明確HLF在降壓降脂、抗動脈粥樣硬化方面具有明顯療效，已應用于冠心病、心絞痛、高血壓等心血管疾病的治療[7]，但HLF對惡性膠質瘤治療作用的相關研究報道較少。因此，本實驗以膠質瘤U87細胞為研究對象，探討HLF對U87細胞增殖、黏附、遷移和侵襲的影響，期望可以更好地利用山楂葉這一豐富低廉的藥用資源，為今后HLF的抗腫瘤臨床應用及進一步合理開發其藥用價值提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑HLF(含量93.5%)，購于山東臨沂愛康藥業。DMEM高糖培養基、Transwell小室，購自HyClone公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、0.25%胰蛋白酶，購自Gibco公司；Matrigel膠，購自Corning公司；二甲基亞砜(dimethyl-sulfoxid,DMSO)，購自Sigma公司；CCK-8試劑盒，購自大連美侖生物技術有限公司。

1.2 儀器CO2培養箱(ESCO公司)；超凈工作臺、高溫滅菌鍋(Biobase公司)；酶標儀(基因有限公司)；倒置顯微鏡(Olympus公司)；Western電泳儀(Bio-Rad公司)；水平搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；低溫高速離心機(湘儀離心機儀器有限公司)。

1.3 細胞培養U87細胞購自中科院細胞庫。將U87細胞復蘇后，接種于T25細胞培養瓶中，使用DMEM高糖培養基培養，置37 ℃、5% CO2的培養箱中，待細胞長至90%以上，使用0.25%胰酶消化后傳代培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.4 藥物配制及分組稱取HLF 100 mg，溶于1 mL DMSO溶液中，配成濃度為100 g·L-1的母液備用，采用DMEM培養基將藥物母液稀釋成相應濃度。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖能力將已消化的細胞計數，并調整細胞濃度為5×107個·L-1，然后將細胞懸液加入相對應的96孔板內，每孔100 μL細胞懸液，每個濃度設5個復孔。將96孔板在培養箱培養過夜，棄去原培養基，加入含有相對應藥物濃度的培養基100 μL于96孔板內，放置培養箱內培養24 h。每孔分別加入10 μL CCK-8溶液，置于培養箱內2 h后，使用酶標儀在450 nm處測定吸光度。細胞存活率/%=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力將U87細胞消化后均勻鋪在6孔板內，待細胞長至95%左右時，用黃槍頭沿每孔的頂端和底部畫一條直線，將原培養基更換為含不同HLF濃度的培養基，并放置培養箱內8 h。之后棄去培養基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定7 min，PBS洗3次，洗去除殘留固定液，使用光學顯微鏡拍照。細胞遷移率=(初始細胞間隙-實驗組細胞間隙)/(初始細胞間隙-對照組細胞間隙)×100%，設定對照組遷移率為1。

1.7 Transwell法檢測細胞侵襲能力細胞饑餓24 h，將Matrigel膠與培養基按照1∶2的比例混合，每個小室加入30 μL，鋪平且無氣泡，放置培養箱內40 min，使其凝固。使用無血清培養基調整U87細胞密度為6×108個·L-1，并取100 μL加入上室，繼續加入100 μL含不同濃度HLF的無血清培養基，下室加入600 μL相應濃度HLF的含血清培養基。放置培養箱內培養24 h后取出，使用PBS清洗后，加入4%多聚甲醛使其固定10 min，使用棉簽擦去未穿過小室的細胞，加入0.5%結晶紫溶液染色10 min，使用PBS洗去多余培養基，待干燥后拍照。細胞侵襲率=實驗組細胞數/對照組細胞數×100%，設定對照組侵襲率為1。

1.8 黏附實驗檢測細胞黏附能力使用培養基按2∶1稀釋Matrigel，并以40 μL每孔加入96孔板內，放置培養箱內1 h，吸取未凝固的基質膠。將不同濃度的HLF預處理24 h的U87細胞消化，并調整密度為108個·L-1，以100 μL每孔加至96孔板內，放入培養箱90 min。棄去培養基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定7 min，0.1%結晶紫染色10 min，PBS洗3次洗去殘留結晶紫，使用光學顯微鏡拍照。每組拍照結果進行細胞計數，細胞黏附率=實驗組細胞數/對照組細胞數×100%，設定對照組黏附率為1。

1.9 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力細胞消化后，調整細胞密度為1.8×107個·L-1，將U87細胞按100 μL每孔加至6孔板內，放入培養箱內過夜。將原培養基更換為含不同濃度HLF的培養基，放置培養箱內7 d。棄去培養基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定7 min，0.1%結晶紫染色10 min，PBS洗3次去除殘留結晶紫，使用光學顯微鏡拍照。

2 結果

2.1 HLF對U87細胞的增殖抑制作用Fig 1結果顯示，U87細胞在不同濃度的HLF作用24 h后，細胞增殖能力明顯下降，與對照組相比，HLF(25、50、100 mg·L-1)組的細胞存活率分別為75.3%、63.9%(P<0.01)、50.5%(P<0.01)，并隨著藥物濃度的增加，細胞活力明顯降低。

Fig 1 Effects of different concentrations of HLF on proliferation of U87 cells vs control(0 mg·L-1)

2.2 HLF對U87細胞遷移能力的影響Fig 2的劃痕實驗結果顯示，HLF處理8 h后，U87細胞的遷移能力明顯減弱，與對照組相比，HLF(25、50、100 mg·L-1)組的遷移細胞比率分別為73.3%、62.0%、52.7%(P<0.05，P<0.01)。提示HLF能明顯降低U87細胞的遷移能力，且HLF對其遷移能力的抑制具有一定的濃度依賴性。

Fig 2 Effect of HLF on migration ability of U87 cells vs control(0 mg·L-1)

2.3 HLF對U87細胞侵襲能力的影響Fig 3結果顯示，HLF處理24 h后，U87細胞侵襲能力明顯減弱，與對照組相比，HLF(25、50 mg·L-1)組的侵襲細胞比率分別為72.4%、48.9%(P<0.01)。提示HLF能明顯降低U87細胞的侵襲能力。

Fig 3 Effect of HLF on invasion ability of U87

2.4 HLF對U87細胞黏附能力的影響Fig 4結果顯示，HLF處理24 h后，U87細胞黏附能力明顯減弱，與對照組相比，HLF(25、50、100 mg·L-1)組均明顯抑制了U87細胞與基質黏附的能力，抑制率分別為19.5%、40.9%、63.6%(P<0.05，P<0.01)。

2.5 HLF對U87細胞克隆形成的影響Fig 5的克隆形成實驗結果顯示，HLF處理7 d后，細胞克隆能力明顯減弱，與對照組比較,隨著HLF濃度的升高，U87細胞的克隆形成率逐漸降低，呈濃度依賴性。

3 討論

山楂葉在我國資源豐富，具有易得、低毒性的特點。HLF是山楂葉提取物中一系列黃酮類化合物的總稱，如蘆丁、槲皮素、金絲桃苷、葡荊牡黃酮等[8-9]，其具有抗動脈粥樣硬化、降血壓、降血脂、抗氧化應激、抗炎、抗心肌缺血缺氧、抗血管性癡呆、抗細胞凋亡、抗腫瘤等藥理作用[10]。膠質瘤細胞U87細胞是人類最常見、最具侵襲性的腦腫瘤，如何有效抑制惡性腦膠質瘤的復發、黏附、侵襲及遷移已成為目前研究的熱點，HLF抑制腫瘤細胞的研究，將為中藥抗腫瘤研究及進一步開發提供新的思路。

Fig 4 Effect of HLF on adhesion ability of U87

本研究CCK-8法檢測HLF作用后U87細胞存活率的結果顯示，HLF(25、50、100 mg·L-1)組細胞存活率均降低，當HLF濃度>50 mg·L-1時具有統計學意義，且這種作用隨著其濃度的增加而增強。倒置顯微鏡觀察結果顯示，正常對照組細胞大而飽滿，輪廓清楚，細胞間接觸緊密。藥物作用U87細胞24 h時，隨著HLF濃度增加，細胞數量明顯減少，細胞的體積變小，細胞間距變大，細胞出現皺縮、脫落，貼壁細胞輪廓模糊。CCK-8實驗結果證明，HLF可以抑制U87細胞的增殖。遷移是腫瘤細胞轉移過程中必不可少的環節之一，劃痕實驗結果顯示，HLF作用U87細胞后，隨著HLF濃度的增加，與對照組相比，U87細胞遷移比率明顯下降，提示HLF可以抑制U87細胞的遷移能力，具有一定的濃度依賴性。腫瘤細胞與母體瘤分離，穿越血管壁，侵襲周邊正常組織時，需要一定的侵襲能力，高侵襲的腫瘤細胞通常具有較強的運動性。Transwell體外侵襲遷移模型模擬在體外U87細胞的侵襲狀況，結果顯示，隨著HLF濃度的增加，與對照組相比，U87細胞侵襲數目均明顯下降，提示HLF能夠有效抑制U87細胞的侵襲。細胞的黏附性在維持細胞外形、調節細胞分裂、運動等功能中起十分重要的作用，黏附是腫瘤細胞侵襲的始動步驟。黏附實驗結果顯示，HLF作用U87細胞24 h后，隨著HLF濃度的增加，與對照組相比，U87細胞黏附能力明顯減弱，提示HLF可以抑制U87細胞與基質黏附的能力。

綜上所述，HLF對膠質瘤U87細胞的生長增殖、遷移、侵襲及黏附能力有一定的抑制作用，但其作用機制尚不清楚。現已公認，可以通過ERK和Akt信號通路抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等功能[11-12]，但HLF是否通過該信號通路對U87細胞產生抑制作用，還有待我們進一步探討和研究。

Fig 5 Effect of HLF on cell clonality of U87 cells