N-(5-對氟芐叉基繞丹寧)環丙沙星酰胺衍生物對人肝癌細胞增殖、凋亡和自噬的影響

梁紅霞，陳超然，伊 丹，余令兵，康玉華，胡國強，劉 彬

(河南大學1. 護理與健康研究所、2. 淮河臨床學院、3. 藥學院，河南 開封 475004)

氟喹諾酮類藥物是廣泛使用的臨床一線抗感染藥物，經過結構修飾有可能將此類藥物改造成為抗腫瘤藥物[1-2]。本研究用酰胺基作為氟喹諾酮C-3羧基的電子等排體，繞丹寧環為其修飾基，對氟芐叉基為修飾基的功能修飾側鏈構建繞丹寧不飽和酮骨架，運用藥效團拼合藥物設計原理，設計合成了一系列N-(5-芳芐叉基繞丹寧)氟喹諾酮類衍生物，并進行了抗腫瘤活性篩選。結果顯示，該類衍生物均具有較好的抗腫瘤活性，其中1-環丙基-6-氟-7-(4-甲基-哌嗪-1-基)-N-(5-對氟芐叉基-繞丹寧-3-基)-喹啉-4-(1H)-酮-3-甲酰胺(HGQ-15)活性最強，IC50值達3.89～4.53 μmol·L-1，具有進一步研究和開發的價值。在對新合成化合物的研究過程中，發現抗腫瘤藥能夠誘導腫瘤細胞自噬，并對腫瘤細胞的增殖和凋亡產生影響[3]。自噬現象可能是影響藥物療效和產生耐藥機制的重要因素，是藥物研究開發中需要重視的問題[4]。本文通過檢測HGQ-15對人肝癌SMMC-7721細胞株的作用，初步研究了HGQ-15抑制細胞增殖，促進細胞凋亡以及與自噬作用的關系，為該類化合物抗癌作用的應用和開發提供一定的體外實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料人肝癌細胞系SMMC-7721，購自中國醫學科學院基礎醫學研究所。N-(5-芳芐叉基繞丹寧)環丙沙星酰胺衍生物，由河南大學化學生物學研究所設計合成，HPLC法測定純度>99%。四甲基偶氮唑鹽(MTT)(Solarbio公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(七海復泰公司)；Trigol總RNA提取試劑、鼠抗人β-actin單克隆抗體(鼎國昌盛公司)；兔抗LC3B多克隆抗體(Sigma)；氯喹(chloroquine，CQ)(Santa Cruz公司)。凝膠成像系統(UVP公司)；流式細胞儀(艾森公司)。

1.2 MTT法測定細胞存活率SMMC-7721細胞以1.5×107·L-1濃度接種于含HGQ-15的培養液培養，加入5 g·L-1MTT 20 μL培養4 h ，加入DMSO 150 μL振蕩溶解,測定570 nm處的吸光度(A)值并計算存活率。

1.3 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡400 μL 1×Binding buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，避光孵育15 min。加入10 μL PI染色液，冰浴5 min，流式細胞儀檢測，激發光波長為488 nm。

1.4 Western blot法檢測細胞LC3表達低溫提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE分離樣品，轉膜，封閉。一抗(1∶500)4 ℃震蕩孵育過夜，二抗(1∶5 000)室溫震蕩孵育2 h，ECL顯影。

1.5 Beclin-1基因沉默實驗Beclin-1 siRNA的干擾正義序列：5′-UGAAUGAGGAUGACAGUGATT-3′，反義序列：5′-UCACUGUCAUCCUCAUUCATT-3′；正義序列：5′-UUCUCCG AACGUGUCACGUTT-3′，反義序列：5′-ACGUGACACGUUCGG AGAATT-3′。轉染使用siRNA-Mate轉染試劑，按試劑盒說明操作。

2 結果

2.1 HGQ-15抑制SMMC-7721細胞增殖HGQ-15(0.625～10.0 μmol·L-1)處理SMMC-7721細胞24、48、72 h，對細胞增殖有明顯抑制作用(P<0.05)，不同濃度HGQ-15對SMMC-7721細胞增殖抑制率數據見Tab 1。24、48、72 h的IC50分別為4.531 μmol·L-1(r2=0.874 2)、4.063 μmol·L-1(r2=0.857 3)和3.894 μmol·L-1(r2=0.959 0)。

Tab 1 Proliferation inhibitory ratio of HGQ-15 on SMMC-7721 cells

2.2 HGQ-15誘導SMMC-7721細胞凋亡隨著HGQ-15濃度增加，凋亡細胞明顯增多，細胞凋亡率見Tab 2。與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01)。

Tab 2 Effects of HGQ-15 on apoptosis of SMMC-7721 cells

2.3 HGQ-15對SMMC-7721細胞自噬的影響不同濃度HGQ-15處理24 h后，SMMC-7721細胞LC3-Ⅱ的表達量增加，表明HGQ-15誘導SMMC-7721細胞發生自噬。

2.4 Beclin-1 siRNA和氯喹對HGQ-15抑制細胞增殖作用的影響Beclin-1 siRNA對SMMC-7721細胞增殖率的影響不明顯，但Beclin-1 siRNA與HGQ-15(2.5 μmol·L-1)共同處理組細胞增殖率明顯低于HGQ-15(2.5 μmol·L-1)單獨處理組(P<0.05) ；單獨使用6.25 μmol·L-1氯喹時，對SMMC-7721細胞增殖率影響較小，但氯喹與HGQ-15共同處理后，明顯增加HGQ-15對細胞增殖的抑制效果(P<0.05)。

2.5 Beclin-1 siRNA和氯喹對HGQ-15誘導細胞凋亡的影響與HGQ-15(2.5 μmol·L-1)單獨處理組相比，HGQ-15(2.5 μmol·L-1)聯合Beclin-1 siRNA組細胞凋亡率明顯增高；HGQ-15(2.5 μmol·L-1)聯合氯喹(6.25 μmol·L-1)組的細胞凋亡率也高于HGQ-15(2.5 μmol·L-1)單獨處理組，差異有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

已有研究證明，通過改造碳-3羧基的氟喹諾酮衍生物顯示出類似DNA拓撲異構酶Ⅱ毒劑的作用，能導致DNA損傷，誘導細胞凋亡[5]。本研究應用MTT法檢測HGQ-15對SMMC-7721細胞增殖的影響，IC50值達到4.531 μmol·L-1。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法觀察HGQ-15對SMMC-7721細胞凋亡的影響，觀察到隨著HGQ-15濃度升高，凋亡細胞的比率明顯。說明HGQ-15對SMMC-7721細胞的抑制作用與誘導凋亡作用有關。

本實驗用Western blot方法檢測自噬標志物LC3的表達，顯示HGQ-15處理組表達量明顯高于對照組，說明HGQ-15能夠誘導細胞發生自噬。為探究HGQ-15誘導自噬與凋亡的關系，本研究應用RNA干擾技術下調自噬通路中關鍵蛋白Beclin1[6]和自噬抑制劑氯喹，阻斷自噬體和溶酶體融合形成自噬溶酶體的過程[7]，特異性抑制細胞自噬活動，觀察自噬對細胞增殖和凋亡的影響。結果顯示，Beclin-1基因沉默和氯喹(6.25 μmol·L-1)本身對細胞增殖影響甚微，但與HGQ-15聯用后，可明顯增加HGQ-15對SMMC-7721細胞增殖的抑制作用(P<0.05)。與此相一致的是，Beclin-1基因沉默和氯喹(6.25 μmol·L-1)與HGQ-15聯合處理SMMC-7721細胞時，細胞的凋亡率明顯高于HGQ-15單獨處理組(P<0.05)。提示在HGQ-15導致SMMC-7721細胞凋亡過程中所誘導的細胞自噬，對細胞具有保護作用，通過自噬作用減少HGQ-15對SMMC-7721細胞的增殖抑制作用，并降低細胞的凋亡率。