纖維素/海藻酸鈉基雙膜水凝膠的制備及其藥物控釋研究

許孟杰，陳華泉，周雪松

(華南理工大學 制漿造紙工程國家重點實驗室，廣東 廣州 510640)

海藻酸鹽可以從天然褐藻中獲得，具有生物相容性、低毒性、成本低廉、容易與二價金屬離子凝膠化等優點，被廣泛用于制備水凝膠并應用在生物醫學領域，尤其是蛋白質和藥物的傳輸[1]。海藻酸鹽基水凝膠運用于藥物傳輸，一般方法是將目標藥物包封在三維網絡結構的水凝膠中，通過擴散和水凝膠的瓦解來實現藥物穩定釋放[2]。纖維素是一種天然高分子，來源廣泛、生物相容性好、無毒，故纖維素被應用在藥物醫學方面有天然的優勢，并有較長的歷史[3]。但以往研究纖維素材料作為藥物載體，僅考慮了單藥物傳輸系統，而缺乏復合藥物傳輸系統的研究[4]。近5年來，各種生物高分子聚合物(殼聚糖[5]、海藻酸鹽[6-7]、羧甲基纖維素[8])被研究制作多層膜水凝膠材料。本研究旨在開發陽離子纖維素和陰離子海藻酸鹽的雙膜水凝膠材料，并作為新型復合藥物載體。因為構建水凝膠的兩組分都是天然多糖，故雙膜水凝膠的生物相容性和無毒性得以保證。

對于藥物釋放，如果藥物傳遞系統能逐漸釋放活性成分，則可以確保長時間的治療水平，克服活性物質半衰期短的缺點[9]。本研究選用牛血清白蛋白和茶堿為模型藥物，分別擔載在雙膜水凝膠的內外層，探究雙膜水凝膠作為新型藥物載體的復合藥物釋放效果。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

微晶纖維素、海藻酸鈉(SA)、牛血清白蛋白(BSA)、考馬斯亮藍G250、氫氧化鈉(NaOH)、脲、氯化鈣(CaCl2)、(3-氯-2羥丙基)三甲基氯化銨溶液(CHPTAC，65%)、茶堿(藥典BP級)均為分析純，無需純化可直接使用。

FTIR-Nexus 670紅外光譜儀；AVANCE AV 400超導核磁共振譜儀；EV018掃描電子顯微鏡(SEM)；UV8453紫外分光光度計；Vario EL cue型元素分析儀；OLYMPUS光學顯微鏡。

1.2 陽離子纖維素的制備

合成路線如下：

按照氫氧化鈉∶脲∶水質量比為7∶12∶81 的比例配制 100 g 溶液[10]，放置在冰箱中預冷至-12 ℃，然后快速將2 g纖維素加入配制好的溶液中，高速攪拌 5 min。隨后，將得到的溶液轉移到離心管中，放入冷凍離心機中，8 000 r/min 條件下離心10 min，除去氣泡和少量未溶解的纖維素，即得透明的濃度為2%纖維素溶液，0～5 ℃下封口存放待用。

將不同量的CHPTAC加入到纖維素溶液中，在25 ℃條件下攪拌反應24 h后，用HCl將反應后的溶液中和到pH=7。然后加入2倍體積的無水乙醇，攪拌，砂芯漏斗抽濾，無水乙醇洗滌數次后，于 60 ℃下真空干燥24 h，得到白色顆粒狀固體，即為陽離子纖維素。根據CHPTAC與纖維素不同的物質的量比，合成兩種陽離子纖維素CC-1、CC-2。

1.3 陽離子纖維素的表征

紅外光譜(FTIR)采用傅里葉變換紅外光譜儀，以溴化鉀壓片。核磁分析13C NMR采用核磁共振譜儀，以重水(D2O)為溶劑。

采用元素分析儀測定陽離子纖維素氮元素含量，根據氮元素的含量計算陽離子纖維素的取代度(DS)，公式為：

1.4 水凝膠的制備

1.4.1 單膜水凝膠 分別配制0.15%(質量分數)的陽離子纖維素溶液(CC-1)、0.15%(質量分數)陽離子纖維素溶液(CC-2)、1.5%(質量分數)海藻酸鈉溶液。混合陽離子纖維素溶液和海藻酸鈉溶液，用噴嘴直徑為3 mm的注射器吸取上述混合溶液，將混合溶液通過注射器滴入到0.2 mol/L的CaCl2的水溶液中，交聯反應1 h，產生水凝膠。用去離子水沖洗掉水凝膠表面的Ca2+，然后用濾紙吸收水凝膠表面的水。分別制備出純海藻酸鈉水凝膠(SA)、海藻酸鈉/陽離子纖維素水凝膠(SA/CC-1、SA/CC-2)。

1.4.2 雙膜水凝膠 將制得的單層膜水凝膠放置在1.5%(質量分數)海藻酸鈉溶液中，放置不同的時間(5 min，20 min，1 h，3 h，6 h)。當單層膜水凝膠吸收完不同量的海藻酸鈉溶液后，將其轉移到0.2 mol/L 的CaCl2溶液中交聯形成第二層海藻酸鈉膜。制備雙層膜水凝膠的路線見圖1。

圖1 單膜和雙膜水凝膠制備流程Fig.1 Preparation process of single-membrane and double-membrane hydrogels

1.5 水凝膠結構表征

1.5.1 光學顯微鏡 用光學顯微鏡觀察單膜、雙膜水凝膠的形貌，放大倍數為10倍。將球形水凝膠放置在長方形石英比色皿上，然后滴加去離子水直至完全浸沒水凝膠。

1.5.2 掃描電鏡 通過SEM進一步觀察冷凍干燥后的水凝膠的表面和內部結構，在觀察之前，所有樣品都鍍金，在10 kV的加速電壓下進行SEM操作。

1.6 體外藥物釋放研究

1.6.1 單膜水凝膠 以牛血清白蛋白為模型藥物探究單膜微球水凝膠體外藥物釋放行為。制備擔載藥物的微球體水凝膠，首先將牛血清白蛋白溶解在海藻酸鈉、陽離子纖維素混合水溶液中并不斷攪拌，牛血清白蛋白的濃度為0.1%(w/v)。然后吸取上述混合溶液滴加到0.2 mol/L的CaCl2溶液中，交聯反應1 h制得擔載牛血清白蛋白的微球體水凝膠。將擔載了藥物的微球體水凝膠分別浸入到pH=2.0和pH=7.4的緩沖液中，溫度為37 ℃的條件下進行藥物釋放性能的研究。分別在pH=2.0和pH=7.4的條件下進行藥物釋放實驗，是模擬人體的胃部和結腸部位的pH環境。利用Bradford[11]方法，在預定的時間點取0.8 mL待測液，用紫外分光光度計測量其在595 nm處的吸光度，進而檢測釋放出牛血清白蛋白的濃度。待測定完成后，向待測液中加入另外的0.8 mL新鮮緩沖液，保持待測液總體積恒定。根據標準曲線可以確定牛血清白蛋白的累積釋放率。

1.6.2 雙膜水凝膠 兩層膜擔載不同的藥物，內層擔載牛血清白蛋白，外層擔載茶堿，研究不同藥物的釋放行為。類似于單層膜藥物釋放研究，將擔載了藥物的雙層膜水凝膠浸入到pH=2.0和pH=7.4的緩沖液中，溫度為37 ℃的條件下進行藥物釋放性能的研究。在預定的時間點取3 mL待測液，用紫外分光光度計于波長273 nm處測定溶液的吸光度，進而檢測釋放出茶堿的濃度。同時取0.8 mL待測液，利用Bradford方法，用紫外分光光度計于波長595 nm處測定溶液的吸光度，確定釋放出的牛血清白蛋白的濃度。測定完成后，向待測液中加入等額的新鮮緩沖液，維持待測液總體積恒定。

1.7 溶脹/侵蝕行為

將雙層膜水凝膠浸沒在pH=2.0和pH=7.4的緩沖液中，研究溶脹行為。在特定的時間間隔，取出吸水后的水凝膠，用濾紙去除水凝膠表面的水分，用質量法算出水凝膠的溶脹率(SR)。

其中，Ws是吸水后的水凝膠質量，Wd是初始水凝膠的質量。

2 結果與討論

2.1 陽離子纖維素表征

通過元素分析測定不同樣品(CC-1、CC-2)的氮元素含量及取代度，結果見表1。

表1 樣品元素分析及取代度Table 1 Elemental analysis and substitutiondegree of samples

陽離子纖維素的紅外光譜見圖2。

圖2 陽離子纖維素(樣品CC-2)紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectrum of cationic cellulose (sample CC-2)

由圖2可知，陽離子纖維素與纖維素最明顯不同之處在于1 474 cm-1處的吸收峰，對應于銨鹽基團中的甲基。此外，1 378 cm-1處是C—N鍵的吸收峰。紅外圖譜表明，季銨鹽陽離子基團被成功引入到了纖維素分子鏈上。

將陽離子纖維素溶于氘代水中，其13C NMR 譜圖見圖3。

由圖3可知，化學位移102.4，78.5分別對應于葡萄糖單元上的C1、C4吸收峰；化學位移73.0處為葡萄糖單元上的C2、C3和 C5的吸收峰；而在此化學位移處還有一吸收峰，幾乎與 C2，3，5的吸收峰重合，應歸屬于陽離子醚化劑3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨(CHPTAC)中亞甲基中的碳原子(C7)；化學位移60.0對應于亞甲基碳C6；在化學位移68.2處為季銨鹽陽離子基團中位于氮原子與羥基碳原子之間的碳原子(C9)；位于65.2處的吸收峰則歸屬于陽離子醚化劑中連接羥基的碳原子(C8)；在 54.4附近有一個強烈的吸收峰，應為季銨鹽陽離子基團中連接氮原子的三個甲基碳原子(C10)吸收峰。根據碳譜的結果，進一步證明，在NaOH/脲溶劑體系中，成功合成了陽離子纖維素。

圖3 陽離子纖維素的13C NMR譜圖(樣品CC-2，DS=0.41)Fig.3 13C NMR spectra of cationic cellulose

2.2 水凝膠的形態結構

用光學顯微鏡觀察球體單膜和雙膜水凝膠的結構，結果見圖4。通過控制吸收純海藻酸鈉的時間，水凝膠外層膜的厚度從35(5 min)～700 μm(3 h)。具體厚度見表2。因為水凝膠的厚度太小或太大都不利于藥物的控制釋放，故在進行水凝膠的復合藥物釋放研究時，選用了持續吸附純海藻酸鈉1 h而制備成的雙膜水凝膠。

圖4 水凝膠的光學顯微鏡照片Fig.4 Optical microscopic photographs of hydrogels

樣品樣品厚度/μm5 min20 min1 h3 hSA/CC-135.388.2152.9682.4SA/CC-241.2105.9164.7710.5

水凝膠冷凍干燥后，用掃描電鏡觀察其整體和內部的形貌，結果見圖5。

圖5 水凝膠的SEM圖Fig.5 SEM images of hydrogels a.SA單膜水凝膠；b.SA/CC-2單膜水凝膠； c.SA/CC-2-1h雙膜水凝膠；d.SA/CC-2-3h雙膜水凝膠

由圖5a和5b可知，SA/CC單膜水凝膠與SA水凝膠的塌陷表面形態相比，表現出更規則和完全球形的形態。這是由于剛性纖維素的存在，可以防止海藻酸鈉基水凝膠結構倒塌和增強其結構穩定性。由圖5c和5d可知，SA/CC-1h和SA/CC-3h水凝膠的雙膜結構，一個薄薄的外膜覆蓋了內部水凝膠表面。

2.3 單膜水凝膠的藥物釋放特性

單膜水凝膠的藥物釋放行為(BSA)是pH敏感的，在溫度37 ℃，pH=7.4和pH=2.0緩沖液中3種單膜水凝膠的累積藥物釋放曲線見圖6。

由圖6a可知，在pH=7.4條件下，3種單膜水凝膠SA、SA/CC表現出不同的藥物釋放行為。與純海藻酸鈉水凝膠SA快速釋放牛血清蛋白(3 d)相比，SA/CC-1水凝膠釋放牛血清白蛋白的效果明顯緩慢，延長至6 d，SA/CC-2甚至可以控制釋放至8 d。在形成穩定的交聯結構的基礎上，SA/CC水凝膠能延緩牛血清白蛋白釋放，一是相比于SA水凝膠，剛性纖維素鏈的存在可延長藥物擴散的路徑；二是陽離子纖維素與海藻酸鹽之間存在強的靜電作用，可以進一步延緩藥物的釋放，故陽離子化程度更高的SA/CC-2水凝膠控釋牛血清白蛋白的效果最好。由圖6b可知，在pH=2.0的條件下，所有水凝膠的牛血清白蛋白釋放量明顯減少，因為海藻酸鹽在酸性條件下會變得更緊密，滲透性更低。同樣由于陽離子纖維素與海藻酸鹽之間的靜電作用，SA/CC-1和SA/CC-2水凝膠的3%牛血清白蛋總釋放量，明顯低于SA水凝膠的6%總釋放量。

圖6 單膜水凝膠的牛血清白蛋白釋放研究Fig.6 Bovine serum albumin release of single-membrane hydrogela.pH=7.4；b.pH=2

2.4 雙膜水凝膠的復合藥物釋放特性

由圖7可知，關于茶堿的釋放，SA/CC-1-1h，SA/CC-2-1h雙膜水凝膠表現出相似的行為，即pH=7.4條件下藥物分子在3 d內快速釋放。這兩種水凝膠有相同組分和結構，快速釋放茶堿可歸因于外部純海藻酸鹽膜的溶脹和崩解。在茶堿釋放的前3 d期間，沒有檢測到牛血清白蛋白的釋放，這表明復合藥物是從雙膜水凝膠中有序釋放出來的。對于SA/CC-1-1h雙膜水凝膠，牛血清白蛋白在4 d后開始釋放，并從第6 d到第8 d快速釋放，第9 d達到平衡。然而，SA/CC-2-1h雙膜水凝膠表現出不同的牛血清白蛋白藥物釋放行為，其藥物的持續釋放延長至7～8 d(從第4 d開始釋放并在第11 d或第12 d 達到平衡)。這種結果和研究單膜水凝膠藥物釋放行為類似，即作為水凝膠組分之一的纖維素的陽離子化程度越高，兩組分之間的靜電作用更強，藥物的延緩釋放效果越顯著。

圖7 在pH=7.4緩沖溶液中雙膜水凝膠的復合藥物釋放曲線Fig.7 Complexing drug release curve of double-membrane hydrogel in pH=7.4 buffer solution

2.5 溶脹侵蝕行為

為了探究復合藥物釋放的過程，在pH 7.4和pH 2.0條件下對SA/CC-2-1h雙膜水凝膠進行溶脹/侵蝕實驗，結果見圖8。

圖8 在pH=7.4(a)和pH=2(b)條件下SA/CC-2-1h雙膜水凝膠的溶脹/侵蝕行為Fig.8 Swelling/erosion behavior of the SA/CC-2-1h double-membrane hydrogel under pH 7.4 and pH 2.0 conditions

由圖8可知，基于雙膜水凝膠內外膜不同的結構特點，溶脹/侵蝕展現出兩個不同的過程。pH=7.4時水凝膠的外層膜在第1 d吸水溶脹，然后溶脹率從第1 d～第3 d逐漸減少，這可歸因于外膜水凝膠的逐漸侵蝕。在3 d后，外層全部被侵蝕，內層水凝膠吸水溶脹，溶脹率重新上升，持續5 d，在第8 d能達到180%的最高溶脹率。8 d后，雙膜水凝膠中的內膜水凝膠開始侵蝕，故溶脹率第二次下降。而pH 2.0條件下雙膜水凝膠的溶脹/侵蝕行為則不同，10 d后SA/CC-2-1h表現出很小的溶脹/侵蝕率，為-4%，表明了在酸性條件下海藻酸鹽基水凝膠的收縮行為和結構穩定性。溶脹/侵蝕結果反映了SA/CC-2-1h雙膜水凝膠在不同pH條件下的結構變化，這與復合藥物釋放行為基本一致。

基于單膜和雙膜水凝膠的體外藥物釋放和溶脹行為的結果，可以提出由陽離子纖維素和陰離子SA制備的雙膜水凝膠可能的復合藥物釋放模型，見圖9。

圖9 在pH=7.4下，雙膜水凝膠的復合藥物釋放過程Fig.9 Complexing drug release process of double-membrane hydrogel at pH=7.4

由圖9可知，在pH 7.4條件下，純海藻酸鹽的外膜經歷溶脹，部分和完全瓦解，快速釋放茶堿。對于內膜，存在剛性的陽離子纖維素鏈與陰離子海藻酸鹽之間的靜電相互作用，促進了內部水凝膠的結構穩定性。因此，在pH 7.4條件下，內膜經歷比外膜更長的溶脹和瓦解過程，故內部水凝膠擔載的藥物可以實現緩慢釋放。值得注意的是，作為藥物傳輸系統的雙膜水凝膠實現了復合藥物釋放，其中一種藥物快速釋放，另一種藥物緩慢釋放。

3 結論

制備出了海藻酸鹽/纖維素雙膜水凝膠，并作為一種新型復合藥物載體。內膜中存在陽離子纖維素，可以通過其與陰離子海藻酸鹽之間的靜電相互作用增強水凝膠的結構穩定性。內外部水凝膠的不同組成和特性使得藥物釋放的效果不同，在復合藥物的傳輸中，達到快速釋放茶堿和持續緩慢釋放牛血清白蛋白的目的。本研究中生物相容性水凝膠展現出特殊的雙膜結構和復合藥物控釋行為，可以應用到口服給藥等生物醫學領域。