淺析植物系統學中葉綠體基因組分析技術的應用

摘 要：本文主要介紹了植物細胞內葉綠體基因組，包含葉綠體基因組發現、特點以及結構、進化特點編碼基因與遺傳方式。講述了DNA雜交、DNA限制酶譜分析、BFLP的分析等多項技術的特點、原理以及應用。講述植物細胞內葉綠體DNA在植物系統學當中的應用，以及廣泛應用使存在的優點和缺點。

關鍵詞：葉綠體基因組;植物系統學;DNA分析技術

中圖分類號：S-3

文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20190815010

引言

隨著科技的不斷進步，生物技術也在不斷的朝著新的方向進行革新和改進，能夠更好地幫助人們對大片段的DNA分子進行分析。在科技手段不斷進步的影響下，近些年通過對比DNA來研究系統發育的問題已經成為一門專業的學科[CD1*2]分析系統學。葉綠體基因組具有易分析以及保守性的特點，研究人員在對系統發育的研究過程中經常使用cpDNA，對葉綠體分子系統學的研究也飛速興起。本文主要就是講述葉綠體基因組分子技術以及該項技術在植物系統學當中的應用情況進行簡要的概述。

1?葉綠體基因組簡介

1.1?發現

Ris在1962年用電子顯微鏡觀察玉米和衣藻等植物時發現葉綠體內部有DNA纖維，證實了葉綠體內部存在DNA分子。

1.2?結構以及特點

植物細胞內的cpDNA分子長度約為120～160kb。多數DNA分子是閉合共價雙鏈形狀，極少數是線狀。

1.3?編碼基因

葉綠體基因組編碼了自己所有使用的tRNA以及rRNA，葉綠體細胞內有數百種蛋白質及多肽但只編碼一小部分。大多數的蛋白復合體需要核基因組與葉綠體基因組一起編碼完成。

1.4?進化的特點

陸地植物的cpDNA各個方面的進化速度十分緩慢，表現為：全部陸生植物的葉綠體基因組的大小、編碼基因排列順序以及數目順序;細胞器葉綠體的編碼基因高度保守。

2?葉綠體基因組技術以及該技術在遺傳方式當中屬于單親遺產

2.1?DNA的雜交技術

DNA的雜交是不同來源DNA經過解鏈后互補配對的DNA部分重新退火或者聯合的過程。DNA溶解溫度和2條子鏈的互補性成正比，雜交的DNA分子比同源的DNA分子的Tm值低，對同源DNA分子和雜交DNA進行Tm值的對比，可以推測分類群DNA間共同的序列區域占據的比重，從而判斷親緣的關系。在很久之前cpDNA就已經證明，所有的雙子葉植物，葉綠體細胞器中的基因組在各科間有同樣的差異。但是DNA雜交技術實施起來較復雜，獲得的結果不是十分準確，有諸多不確定因素，需要大量DNA，因此這項技術被cpDNA技術取代。

2.2?DNA限制酶譜分析

DNA限制酶譜分析是指DNA分子上全部的酶切點所在的位置圖。植物的種屬之間品種之間同源的DNA序列上針對不同的限制酶識別的位置也不盡相同，把純化后的DNA分子使用不同的限制性內切酶對其進行切割，然后進行凝膠電泳分析。對cpDNA要求找到對該DNA分子僅有1個切點的內切酶，用這個作為參考點，依據圖譜上酶切段的長度，找到各個切點的位置，并用簡圖表示。這樣做在遺傳學中有著非常重要的意義。

2.3?BFLP的分析

限制酶合理的將DNA分子切割成不同的額片段，片段的大小直接影響著自身在電泳中游動的速度，在凝膠之上形成連續的涂片，經過雜交、放射自顯影之后就可以得到DNA限制性的片段也就是RELP。該分析方法主要原理就是植物的長期進化獲得的結果，在種屬之間甚至是品種之間限制酶的酶切位點大不相同，部分原因就是點發生重組或者突變，造成酶切點處的核苷酸出現插入、缺失以及替換進而無法識別并切割。

自從20世紀80年代以來，發現了更多的cpDNA種內多態性的案例，比如wattier等研究人員使用標記的總cpDNA來做探針，對2種紅藻做了RFLP分析，在實驗的過程中發現了cpDNA中存在多態性，并且在種的水平之上開展其系統發育的研究。

2.4?核苷酸序列的分析

核苷酸分子不單是指導生物的個體發育以及形態建設，還可以反應生物間的親緣關系，當前的生物分子的建設主要就是在這一原理上開展的。對DNA分子序列進行檢測可以直接看出遺傳物質的變異。但該項工作十分艱巨且困難，檢測DNA的難易程度和成本以及片段的長度有著直接的關系，在短時間里很難廣泛的應用到系統學研究當中，目前能夠在植物系統學當中直接應用的只有cpDNA的幾個基因序列，比如：tm基因間隔區、rbcl基因等。

2.5?DNA單鏈構像多態性分析

在自然狀態下，單鏈DNA會彎曲折疊，形成一個有空間結構的結構，這種特點是由DNA鏈上特定的堿基順序所決定的。在SSCP的分析過程中，先設計出特異的引物，用PCR技術對特定點的基因組進行擴增，將擴增的片段進行變性處理讓其變成單鏈，在聚丙烯酰胺凝膠當中電泳。因為該項技術操作起來比較復雜，對操作人員的技術有著十分高的要求，因此在cpDNA系統學的研究過程中沒有廣泛應用。

2.6?核苷酸序列的分析

核酸分子不單指導生物的形態建成以及個體的發育，還可以反映生物間的關系，當前生物分子的系統構建，都是在這個原理上進行的。對DNA序列進行分析可以直接檢測遺傳物質。但是該項目完成還是很艱巨，并且DNA測序工作的成本以及難易程度和片段的長度有著密切的關系，在較短的時間里還無法應用到植物系統學的研究中，當前能夠使用到系統學上的僅有cpDNA的個別基因的序列分析上。由于這個過程太過繁瑣、復雜、工作量大，很難對很多個分類群測序，大大限制了葉綠體基因序列在系統發育研究上的使用。

2.7?PCR-RFLP分析

自從1990年之后，PCR技術開始主要使用在酶切產物檢測上，按照保守序列而設計出可以通用的引物，然后通過PCR反應來擴增一些特定基因，最后酶切純化擴增的片段。擴增的長度并不是很大，經過EB染色可以觀察到限制性片段的長度多態性。該分析方法的優點：不需要將cpDNA進行提純處理;不同使用放射性同位素標記，且不受半衰期的影響，對實驗室的污染較輕;使用的植物材料少;對植物材料的要求不嚴苛;擴增后的產物特異性非常可靠。因此該項分析方法是當前使用最為廣泛的技術，還是物種鑒別、遺傳探究、品系鑒定以及中間雜種等多領域研究的主要工具。

2.8?微衛星序列分析

以葉綠體微衛星序列兩側共有序列當做引物隊，進而在不同植物間擴增出葉綠體微衛星序列。該引物隊伍一定要符合的標準：擴增的片段要有多態性;靶序列一定要有較高的保守性;擴增的片段比較短進而確保片段在測序膠上可以達到一個bp分辨率。

3?植物細胞內葉綠體DNA在植物系統學當中應用時存在的優點及缺點

3.1?優點

植物葉綠體基因組有2大特點為系統的發育提供了巨大的優勢。核基因組是第1大基因組，葉綠體基因組是第2大基因組，為對比研究提供了很大的數據;cpDNA的核算置換效率適中。葉綠體基因組的非編碼區以及編碼區的分子進化速度差距較大，適用于多個層次的系統學研究。

3.2?缺點

CpDNA在研究系統發育時有著一定的局限性。葉綠體基因組是母系遺傳，可以發現不能只單純的依靠葉綠體基因組來結合種群之間的雜交;雖有很多的cpDNA分子被用來標記研究種群間的系統發育的關系，但是只有將片段反映出的信息和其他片段反映出的信息、生理特征以及傳統的形態相結合，這樣才能夠越來越接近系統發育的真正面目。

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作者簡介：

張妙娟（1982-），女，碩士研究生，講師。研究方向：植物系統學和資源開發利用研究。