肉鴨漿膜炎的診斷和治療

周德剛，左春生

(1.洛陽惠中獸藥有限公司，河南 洛陽 471000；2. 信陽農林學院 牧醫工程學院，河南 信陽 464001)

鴨傳染性漿膜炎(infectious serositis of duck)又稱鴨疫里氏桿菌病，由鴨疫里氏桿菌(R.anatipestifer)引起的鴨、鵝、火雞等禽類的急性或慢性敗血性傳染病，在世界范圍內廣泛存在，目前已成為嚴重危害養鴨業生產的主要疾病，該病以纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為主要病變特征，病死率高達90%，給養鴨業造成了巨大的經濟損失[1-4]。該病菌通常存在于患病動物的全身各組織、分泌物和排泄物中，不良因素刺激、抵抗力下降、病菌侵入機體等引起發病，天氣氣候突變極易暴發，給養殖場造成很大的經濟損失。信陽地區水網密布，適合鴨的養殖，鴨的養殖量位居河南省首位，但鴨漿膜炎較常發生，給養殖戶帶來較大經濟損失。為更好地防治該病，作者將收集到的病死鴨樣品進行細菌分離、鑒定與藥敏試驗，以期為漿膜炎的防控提供參考。

1 發病情況、病料收集

1.1 發病情況

信陽市某肉鴨場，存欄3000只25日齡麻鴨。2019年3月18日發病，病鴨出現精神萎頓、厭食少食、腹瀉排綠色糞便、運動失調、角弓反張等癥狀，到3月23日已經死亡200多只。

1.2 樣品采集

取病死鴨全血、肺臟、肝臟、脾臟等部位，2～8℃冷藏被檢；用無菌棉簽取病死鴨口腔、泄殖腔雙拭子樣品，放裝有PBS的離心管中，冷凍保存備檢。

2 檢測方法

2.1 病料剖檢

將病死鴨仰臥于解剖臺上，從胸骨后緣兩側沿肋骨中部剪開，暴露腹腔；再小心剪開頭部皮膚，露出腦膜，觀察并記錄其病理變化。

2.2 細菌分離、鏡檢

用無菌刀剪取新鮮死鴨病變明顯部位，劃線接種于麥康凱瓊脂平板、巧克力平板上，在37℃溫箱中培養24h以上，觀察菌落生長情況，并取生長菌落純培養；取病死鴨組織器官、平板上培養物涂片，革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察細菌形態。

2.3 生化鑒定

將純培養物接種于含有5%胎牛血清的LB液體培養基中，隨后取少量培養液加入生化鑒定管中，在溫箱中37℃培養24h后，觀察并記錄結果。

2.4 PCR鑒定及測序

用禽流感通用型PCR檢測試劑盒檢測雙拭子樣品，檢測鴨群是否有禽流感病毒感染。

采用DNA提取試劑盒提取采集組織及分離培養菌的DNA，參照文獻[5]建立的鴨疫里氏桿菌PCR檢測方法操作：設計針對鴨疫里氏桿菌的16SrRNA 特異性引物序列，上游引F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATG；下游引物 R：TACGGCTACCTTGTTACGACTTAGC，預計擴增目的1481 bp；反應條件：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 40 s，52 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 1 min，30 個循環；最后 72 ℃延伸 10 min。

對采集的樣品及培養物進行PCR擴增，電泳檢測，提取陽性質粒送生物公司測序，并將測序結果同已發表的序列進行同源性比較。

2.5 分離菌株的藥敏試驗

采用紙片法[6-7]測定強力霉素、頭孢曲松、新霉素、阿米卡星、阿莫西林、大觀霉素、恩諾沙星、林可霉素、氨芐西林、氟苯尼考等10種藥物對分離細菌的敏感性，通過測定抑菌圈的直徑(Φ)判定藥物對鴨疫里氏桿菌的敏感性。

2.6 檢測用儀器及試劑

所用儀器：光學顯微鏡(上海無陌光學儀器有限公司)；臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀)；熒光PCR儀、核酸提取儀(杭州朗基科學儀器有限公司 )；PCR儀(美國伯樂公司)；電泳儀、凝膠成像系統(北京六一生物科技有限公司)；數顯恒溫水浴鍋；生化培養箱。

主要檢測試劑：禽流感病毒通用型單重熒光PCR檢測試劑盒(批號：20180906)，購自北京億森寶生物技術有限公司；普通Tap DNA聚合酶、10×緩沖液、dNTP、DNA Marker、瓊脂糖等購自大連寶生物工程有限公司；DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；LB培養基、麥康凱平板、巧克力瓊脂平板、胎牛血清、革蘭氏染色試劑、細菌生化鑒定管、藥敏片(部分自制)等購自鄭州寶賽科貿有限公司。

3 檢測結果

3.1 觀察癥狀及病理變化情況

從圖1、圖2看到，病鴨角弓反張，倦怠、縮頸、眼鼻有分泌物，排淡綠色糞便；解剖后看到全身漿膜面有纖維性滲出物，典型纖維性心包炎、肝周炎(見圖3)。

圖1病鴨角弓反張 圖2拉綠色稀糞

圖3病死鴨肝臟、心臟上包一層纖維素膜 圖4鴨疫里氏桿菌染色圖片

3.2 細菌分離及鏡檢結果

分離菌在麥康凱平板上不生長，在巧克力瓊脂平板培養后，形成直徑1～2mm菌落，菌落表面光滑、圓形、半透明狀，未出現溶血現象；將分離物和培養菌落直接涂片，革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察，可見兩端鈍圓的短桿狀的球桿菌，革蘭氏陰性(見圖4)，結合生化鑒定試驗結果初步判定為鴨疫里氏桿菌。

3.3 分離菌生化鑒定結果

從表1 可以看出，本試驗分離的菌株氧化酶和觸酶陽性，不發酵葡萄糖、蔗糖，吲哚試驗、VP和甲基紅試驗、脲酶陰性，不產生硫化氫。

表1 分離菌株生化鑒定結果

3.4 分離菌株的PCR鑒定結果

病料提取DNA后，禽流感病毒熒光PCR擴增為陰性，該鴨群無禽流感病毒感染(見圖5)。將分離菌進行普通PCR擴增后，1%瓊脂糖凝膠電泳，在1400bp左右處出現明顯條帶(見圖6)，與期望目的片段一致，將測序結果與已發表的鴨疫里氏桿菌基因序列對比，同源性達99.2%以上，確定本試驗分離菌為鴨疫里氏桿菌。

圖5樣品禽流感病毒擴增結果
M：DNAMarker(DL2000)；1：樣品，P：陽性對照，N：陰性對照圖6病料PCR擴增圖

3.5 藥敏篩選結果

對分離細菌株藥敏試驗結果見表2，大部分藥物對此次試驗分離株是高敏的，阿莫西林、林可霉素中敏，只有氨芐西林耐藥。

表2 巴氏桿菌藥敏試驗情況

注：抑菌圈直徑大于15mm者為高敏藥物；直徑為10～15mm者為中敏藥物；直徑10mm以下者為耐藥。

4 分析與討論

鴨漿膜炎是引起肉鴨死亡的主要疾病之一，主要危害2月齡以內的雛鴨，但以2～3周齡最易感，嚴重者發病率90%以上，死亡率5%～75%不等，給鴨養殖戶帶來較大經濟損失。對鴨群來說，在氣溫驟變或有應激因素存在時，較易發生傳染性疾病，而且以傳染性強、發病率高為特征，多為混合感染，死亡率較高，給診斷和治療帶來難度。本研究采用細菌培養、鏡檢、生化及PCR鑒定等手段在信陽地區發病鴨群中分離到鴨疫里氏桿菌；為防治該病，又采用藥敏試驗篩選出氟苯尼考、頭孢曲松等高敏藥物，為防治該病提供指導。該養殖戶采用清瘟敗毒散配合氟苯尼考拌料治療3天后，未再出現鴨漿膜炎病例，全群病情得到控制。

鴨漿膜炎是常見、多發的禽類傳染病，病原菌可經患病動物的排泄物、分泌物等污染的飼料、飲水、用具和內外環境傳播，也可經消化道傳給健康動物，飛沫、咳嗽排出的帶病菌也可傳播本病。為防控該病，建議鴨場采取綜合性防控措施：一是給予鴨群特異性抵抗力，選擇針對本場流行毒株的鴨漿膜炎疫苗在7日齡、21日齡免疫鴨群；二是加強飼養管理，改善鴨群生長環境，給予營養合理的飼料，定期在飼料中添加保健性藥物和抗應激藥物，提高抵抗力；三是要做好鴨舍的清潔衛生，定期清糞、消毒鴨舍，減少各種細菌傳播因素；四是為了降低藥物的耐藥性，可以采用細菌分離和藥敏試驗篩選防治藥物。