基于Cyclin D1基因敲減探討健骨顆粒促進成骨細胞增殖的機理

楊娟 賈曉康 張楚天 黃云梅 黃美雅 張志恒 孫攀 吳銀生 林燕萍

福建中醫藥大學，福建 福州 350122

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少、骨的細微結構發生改變、骨脆性增加并易于發生骨折為特點的全身性骨骼疾病[1]。根據國際骨質疏松癥基金會的一項最新研究[2]顯示，我國骨質疏松疾病的總患病率為6.6%～19.3%，平均高達13%。據2013年人口普查結果顯示，超過60歲的老人約為2.02億，推測至2050年這一數字可能上升至4億，其中骨質疏松癥或表現出骨密度低下的患者將達到2.12億[3]。生活中人們常常忽視OP的存在，直到發生骨折才被察覺，因此OP也被形象地稱作“無聲無息的疾病”。骨質疏松癥患者早期無明顯癥狀，且缺少有效的診治方法，其引起的高骨折率導致了許多患者殘疾和早逝，給中老年人特別是絕經后婦女的生活帶來了嚴重困擾。研究發現[4]，絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)的發生與諸多因素有關，與女性絕經后雌激素的缺乏關系密切。雌激素的缺乏使成骨細胞和破骨細胞的功能發生改變，骨轉換速度加快使得骨吸收大于骨形成，導致骨密度降低，從而形成絕經后骨質疏松癥。成骨細胞對骨形成、骨代謝和維持成年骨骼系統的正常狀態都發揮著重要作用[5]。因此，探討成骨細胞增殖是研究絕經后骨質疏松癥的重點方向之一。

Cyclin D1是調控細胞周期G1期的關鍵蛋白，可以推動細胞周期由G1/S檢測點進入S期[6-7]。前期研究表明[8-9]，成骨細胞中存在Cyclin D1、CDK4等細胞周期調控蛋白的表達，成骨細胞的增殖與Cyclin D1密切相關。而健骨顆粒能調控成骨細胞G1/S期，加快細胞周期總體進程，促進成骨細胞增殖。本研究將以Cyclin D1基因敲減為切入點，觀察基因敲減后各項指標的表達情況，探討健骨顆粒促進成骨細胞增殖的具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗藥物：健骨顆粒由煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、山藥、黨參等藥物組成，原藥材購自福建省醫藥公司，由福建中醫藥研究院中試車間負責加工制備，每克健骨顆粒含原生藥2.9 g。

1.1.2實驗動物：3月齡SPF級雄性SD大鼠20只，體重(322±20)g，由上海克萊實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(滬)2012-0002，合格證編號：2007000562039。飼養于福建中醫藥大學醫學實驗動物中心，每籠5只，室溫、通風良好、自然光照、自由飲食和活動。

1.1.3實驗試劑：胎牛血清(美國Gbico公司);DMEM高糖培養基(新西蘭Hyclone公司);CCK8試劑盒、β-action抗體、Cyclin D1抗體(武漢三鷹生物技術有限公司);Cyclin D1、 Cyclin E、CDK4、E2F1 PCR引物(上海生物工程技術有限公司);YBR Premix Ex TaqTM PCR Kit(日本TaKaRa公司);sgRNA-EGFP/sgRNA-ERFP/sgRNA-puro慢病毒顆粒、Cas9-puro慢病毒顆粒、普適型陰性對照 sgRNA-EGFP慢病毒顆粒(上海吉凱基因公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1含藥血清的制備：將3月齡SPF級雄性SD大鼠隨機分為健骨顆粒組、生理鹽水組，每組10只，分別以健骨顆粒2 g (kg·d)、生理鹽水2 mL灌胃7 d，于最后一次灌胃1 h后取腹主動脈血制備成含藥血清，-20 ℃保存備用。

1.2.2細胞的傳代培養：用含10%胎牛血清的DMEM培養液，將成骨樣細胞株UMR-106在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。每天換液一次，3 d傳代一次。

1.2.3CRISPR/Cas9基因編輯技術敲減成骨樣細胞Cyclin D1基因

1.2.3.1感染Cas9慢病毒，構建穩定細胞株：取狀態良好處于對數生長的成骨樣細胞UMR-106，通過胰酶消化法分離收集，根據公式(病毒量=MOI×細胞數量/病毒滴度)得出Cas9慢病毒體積，將病毒LV-LV-Cas9-Puro(7768-1)加入六孔板中進行培養，對細胞進行篩選以得到穩定表達Cas9的混合克隆細胞株。

1.2.3.2感染sgRNA慢病毒，敲減Cyclin D1基因：通過胰酶消化法分離收集生長狀態良好的Cas9混合克隆細胞株，配置成5×104個/mL的細胞懸液，分為陰性對照組和基因敲減組。根據公式算出sgRNA慢病毒和普適型陰性對照sgRNA-EGFP 慢病毒顆粒體積(sgRNA基因序列：CTCGCAGCACCCGGTCGTTG)后將病毒加入六孔板孔中。觀察細胞并于培養72 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況，在感染120 h后收集細胞檢測或進行下游實驗。

1.2.3.3Surveyor法(錯配酶法)活性檢驗：感染慢病毒5～7 d后，收集細胞，抽提細胞混合克隆基因組，以sgRNA感染的細胞群DNA為陰性對照，以感染靶位點sgRNA的細胞群為實驗組；靶序列PCR擴增后經過變性，退火，形成錯配，從而被錯配酶識別并剪切。產物跑電泳，比較切割條帶和未切割條帶的比例，反映出Cas9/sgRNA的活性。

1.2.3.4Western-bolt驗證基因敲減細胞：取生長狀態良好的成骨樣細胞，用生理鹽水含藥血清分別干預正常成骨樣細胞、病毒載體陰性對照組、基因減除+成骨樣細胞48 h，運用Western-bolt驗證基因敲減細胞中Cyclin D1是否存在。

1.2.3.5成骨樣細胞增殖曲線分析：將生長狀態良好的成骨樣細胞、基因敲減+成骨樣細胞、陰性對照組細胞，接種于96孔板中，分別于培養1、2、3、4、5、6、7、8 d后每組每次取8個孔，加入CCK8溶液，37 ℃恒溫培養4 h。用酶標儀檢測OD值繪制生長曲線。

1.2.4檢測不同濃度健骨顆粒含藥血清對成骨樣細胞增殖的影響：每組設6個血清濃度，用CCK8法檢測并得出促細胞增殖的最佳含藥血清濃度。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測細胞中Cyclin D1、Cyclin E、CDK 2、CDK 4、Rb及E2F-1 mRNA的表達：用Trizol法提取細胞總RNA，當OD 260/OD 280值在1.8～2.0時，說明提取的RNA純度較好。根據反轉錄試劑盒提供的實驗步驟進行反轉錄，合成 Cyclin D1、Cyclin E、CDK 2、CDK 4、Rb及E2F-1擴增引物，根據兩步法標準采用實時熒光定量SYBR GREEN PCR法檢測擴增程序進行擴增，用參照基因GAPDH對所有樣品進行校正，通過7500型實時定量PCR儀軟件分析，得到RT-PCR擴增曲線和溶解曲線，并比較組間mRNA的相對含量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 統計學處理

2 實驗結果

2.1 成骨樣細胞Cyclin D1基因敲減的鑒定

2.1.1觀察細胞感染效率：感染sgRNA慢病毒72 h后， 成骨樣細胞GFP熒光表達率達80%以上(圖1)。

圖1 熒光顯微鏡同視野下觀察GFP表達情況(A、B均為感染sgRNA慢病毒的Cas9混合克隆細胞)Fig.1 Expression of GFP under the observation of fluorescence microscope in the same field (×100) (A, B are all Cas9 mixed cloned cells infected with sgRNA slow virus)

圖4 各組細胞生長曲線Fig.4 Cell growth curves of each group

2.1.2Surveyor法(錯配酶法)檢測sgRNA活性：由圖2可見，與對照組相比，實驗組在預期位置出現了切割條帶，說明sgRNA具有活性,可以進行后續實驗。

圖2 Surveyor法(錯配酶法)檢測sgRNA活性(-：對照sgRNA感染的細胞群DNA；+：感染靶位點sgRNA的細胞群DNA；M：Marker)Fig.2 Test of sgRNA activity by the Surveyor method (-: control of sgRNA infected cell group DNA; +: cell group DNA infected with Target point sgRNA; M: Marker)

2.1.3Western-bolt驗證基因敲減細胞：結果顯示，正常細胞和病毒載體陰性對照組Cyclin D1表達明顯，而基因敲減細胞表達為明顯下降(圖3)。

圖3 Western-bolt 驗證基因敲減細胞(1：正常細胞組;2：病毒載體陰性對照組;3：基因敲減組)Fig.3 Western-bolt verifies gene knock-down cells (1: normal cells; 2: virus empty vector cell group; 3: gene knock-down group)

2.2 成骨樣細胞增殖曲線分析

通過CCK8法檢測成骨樣細胞增殖曲線。結果顯示，正常細胞和病毒載體陰性對照組細胞在24 h時增殖較慢，24 h后開始加速進入指數生長期；分別于第3天和第4天達到頂峰后開始緩慢生長，隨著培養時間的推移，第7天、第8天開始出現增殖抑制。而基因敲減細胞組較前兩組生長緩慢，無明顯增殖高峰，培養8 d后出現增殖抑制。見圖4。

2.3 不同濃度健骨顆粒含藥血清對成骨樣細胞增殖的影響

CCK8法檢測結果顯示：含藥血清干預48 h后，與正常細胞生理鹽水組相比，正常細胞健骨顆粒組增殖速度變快，病毒載體陰性對照組增殖速度無明顯差異，基因敲減+生理鹽水組和基因敲減+健骨顆粒組增殖速度減慢；與正常細胞健骨顆粒組相比，基因敲減+健骨顆粒組增殖速度減慢；與基因敲減+生理鹽水組相比，基因敲減+健骨顆粒組增殖速度無顯著差異。當濃度達到10%時，細胞增殖速度明顯加快，隨著血清濃度繼續增高，增殖速度變慢。見圖5。

圖5 不同濃度健骨顆粒含藥血清對成骨樣細胞增殖的影響(與正常細胞生理鹽水組比較，*P<0.05，**P<0.01;與正常細胞健骨顆粒組比較，#P<0.05，##P<0.01)Fig.5 Effects of serum containing different concentrations of Jiangu granule on osteoblast proliferation (vs normal cells + saline group, *P<0.05，**P<0.01; vs normal cells + Jiangu granule group, #P<0.05，##P<0.01)

2.4 各組成骨樣細胞中Cyclin D1、Cyclin E、CDK2、CDK4、Rb及E2F-1 mRNA表達水平的熒光定量RT-PCR分析結果

熒光定量RT-PCR結果顯示，含藥血清干預24、48、72 h的細胞組Cyclin D1、CDK2、Rb及E2F-1的mRNA呈逐漸增高趨勢，隨時間同步增長，而各細胞組CDK4、Cyclin E的mRNA表達在48 h時為最高，48 h后開始下降；組間比較顯示，各組細胞含藥血清干預24、48、72 h后，與正常細胞+生理鹽水組相比，正常細胞+健骨顆粒組Cyclin D1、CDK2、CDK4、Cyclin E、Rb及E2F-1 mRNA表達明顯增高，病毒載體陰性對照組無統計學意義，基因敲減+生理鹽水組和基因敲減+健骨顆粒組Cyclin D1、CDK2、Rb及E2F-1 mRNA表達明顯降低；與正常細胞生理鹽水組相比，基因敲減+生理鹽水組和基因敲減+健骨顆粒組干預48 h的CDK4 mRNA表達和干預24 h的Cyclin E mRNA表達明顯降低，其他時間段無統計學意義；與正常細胞健骨顆粒組相比，基因敲減+健骨顆粒組mRNA表達顯著降低；與基因敲減+生理鹽水組相比，基因敲減+健骨顆粒組mRNA表達無統計學意義。見圖6。

圖6 熒光定量RT-PCR分析結果(與正常細胞生理鹽水組比較，*P<0.05，**P<0.01;與正常細胞健骨顆粒組比較，#P<0.05，##P<0.01)Fig.6 Fluorescence quantitative RT-PCR analysis results (vs normal cells + saline group, *P<0.05，**P<0.01; vs normal cells + Jiangu granule group, #P<0.05，##P<0.01)

3 討論

Cyclin D1在細胞增殖過程中起著關鍵作用[10]。在G1期初期，有絲分裂信號刺激Cyclin D蛋白合成，轉運CDK4、CDK6進入細胞核，進而完成下游蛋白的調控，使細胞周期進入S期。研究表明[11-13]，在G1期和G1/S期監測點存在Cyclin D1、CDK2、CDK4、Cyclin E、Rb及E2F-1等調節蛋白，通過調控這些蛋白，可以調節細胞周期進程，從而影響細胞增殖周期。本研究通過體外培養成骨樣細胞UMR-106，利用CRISPR/Cas9技術敲減Cyclin D1基因，在熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況。結果顯示，熒光率達到80%以上，Surveyor法(錯配酶法)活性檢驗證明sgRNA具有活性，Western Blot法檢測Cyclin D1蛋白表達明顯下降，因此可確認Cyclin D1基因被成功敲減，可進行后續研究。

CCK8法和RT-PCR檢測結果顯示，成骨樣細胞Cyclin D1基因敲減后，增值速度明顯慢于正常成骨樣細胞和病毒載體陰性對照組細胞；而細胞周期調節蛋白Cyclin D1、CDK 2、CDK 4、Cyclin E、Rb及E2F-1的mRNA表達水平明顯低于正常成骨樣細胞，增殖速度減緩。通過結果可以推斷，成骨樣細胞Cyclin D1基因敲減降低G1期調節蛋白Cyclin D1表達，其下游蛋白CDK 4、Cyclin E及E2F-1隨之下降，從而減緩成骨樣細胞增殖周期；證實Cyclin D1以及下游信號蛋白的調控是成骨細胞增殖周期的重要環節，Cyclin D1 是成骨樣細胞增殖周期的關鍵點；通過上調Cyclin D1以及下游信號蛋白表達，可以加速細胞周期進程，促進成骨細胞增殖。

祖國醫學認為腎虧脾虛是絕經后骨質疏松癥的發病基礎[14]，腎虛為骨質疏松癥發生的根本，而脾虛是骨質疏松癥產生的重要病機，以補腎健脾、強筋壯骨為治療之法，可有效防止人體骨量的丟失[15]。根據骨質疏松癥的發病機理，近年來運用補腎方藥探討骨質疏松癥分子生物學機制成為基礎醫學研究的熱點[16-17]。在臨床研究和基礎實驗中發現復方中藥能夠促進成骨細胞增殖分化、提高骨密度[18]。林燕萍等[9]針對絕經后骨質疏松癥“腎虧脾虛”的病機特點，以“補先后天”的理論為組方原則，選用煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、黨參、山藥等組成補腎健脾中藥健骨顆粒。前期研究結果表明[19]，補腎中藥健骨顆粒可以提高骨組織中成骨細胞的數量及功能，加速骨合成代謝，從而使骨形成大于骨吸收。同時還發現健骨顆粒能上調成骨細胞Cyclin D1和CDK4的mRNA以及蛋白的表達，下調負性因子p21表達，促使成骨細胞細胞周期加速由G1/S檢查點進入S期，促進成骨細胞增殖。因此，本課題采用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲減成骨樣細胞Cyclin D1基因，進一步探討健骨顆粒是否能夠通過Cyclin D1及其下游蛋白組成的信號通路促進成骨細胞增殖。研究結果顯示，正常細胞健骨顆粒組的Cyclin D1、CDK2、CDK4、Cyclin E、Rb及E2F-1的mRNA表達高于正常細胞生理鹽水組；而Cyclin D1基因敲減后，正常細胞健骨顆粒組mRNA的表達水平明顯高于基因敲減+健骨顆粒組，基因敲減+生理鹽水組和基因敲減+健骨顆粒組的mRNA沒有明顯差異。表明健骨顆粒可以提高體外培養成骨樣細胞調節蛋白Cyclin D1、CDK2、CDK4、Cyclin E、Rb及E2F-1的表達，推進成骨樣細胞細胞周期的進程，促進成骨樣細胞增殖。且Cyclin D1在成骨樣細胞增殖過程對下游信號蛋白也有著重要調節作用，Cyclin D1基因的敲減直接影響著CDK2、CDK4、Cyclin E、Rb及E2F-1的表達，進而影響成骨樣細胞增殖，這也驗證了健骨顆粒含藥血清可以通過調節Cyclin D1，進而調節下游相關信號蛋白表達來促進成骨樣細胞增殖。

本研究結果表明，健骨顆粒能夠通過調節Cyclin D1及其下游信號推進細胞周期進程，促進成骨細胞增殖，達到防治骨質疏松癥的目的。證明了補腎健脾中藥“補先后天”理論的科學性，為健骨顆粒的臨床應用提供了實驗理論依據。