基于網絡藥理學探討骨碎補抗骨質疏松的分子作用機制

張罡瑜 朱璐璐 林瑞婷 李澤云 李敏瑤 王海彬 陳鵬*

1.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405 2.廣州中醫藥大學嶺南醫學研究中心中醫骨傷科實驗室，廣東 廣州 510405 3.廣州中醫藥大學第一附屬醫院關節骨科，廣東 廣州 510405 4.廣州中醫藥大學第一附屬醫院全國中醫髖關節病重點專科，廣東 廣州 510405

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種常見的代謝性疾病，其特點是骨密度降低，骨微觀結構退化，最終導致骨骼脆性增加，骨折危險性增高[1]。其中，髖部骨折最為嚴重，約21%～30%的髖部骨折患者在1年內死亡[2]。隨著人口老齡化進程的逐步加快，OP已成為全球面臨的重要公共健康問題。到2020年，美國50歲以上人群將有大約1 230萬OP患者[3]。我國OP總患病率為 6.6%～19.3%[4]，預計到2050年，我國骨質疏松性骨折患者將達599萬，醫療花費高達254.3億美元[5]。大量研究表明[6-9]，補腎中藥可以提高OP患者的骨密度，改善其疼痛癥狀，在防治OP方面具有獨特的優勢。

骨碎補(rhizoma drynariae)[10]為水龍骨科植物槲蕨的干燥根莖，其性溫味苦，入肝、腎經，具有補腎強骨、療傷止痛之功，用于跌撲閃挫、筋骨折傷、腎虛腰痛、筋骨痿軟等癥。研究表明[11-12]，骨碎補提取物可誘導成骨細胞分化促進骨的合成代謝，防止骨量減少和骨小梁微結構的惡化，臨床上可用于治療OP等代謝性骨病，但其藥效物質基礎和分子機制尚不明確。因此，分析骨碎補的有效成分、作用靶點及潛在機制，從微觀角度展開科學論證闡述，將有利于其臨床推廣應用。

2007年，Hopkins提出“網絡藥理學”(network pharmacology)一詞[13]。其基于“疾病-基因-靶點-藥物”作用網絡，系統觀察藥物對疾病網絡的干預與影響，為研究中藥及復方提供了有效的策略，其整體性、系統性與中醫學“天人合一”的整體觀和辯證論治等理論特色與中藥及復方多成分、多系統、多靶點協同作用的原理殊途同歸。

本文將采用網絡藥理學方法探討骨碎補抗OP的作用機制, 為深入研究骨碎補的抗OP作用提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1骨碎補化學成分的收集：利用中藥系統藥理學數據庫(traditional chinese medicine system pharmacology, TCMSP)和分析平臺(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)搜索骨碎補的化學成分，通過PubChem數據庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取其分子結構，保存為SMILES格式。

1.1.2活性成分篩選：ADME指機體對外源化合物的吸收(absorption)、分布(distribution)、代謝(metabolism)及排泄(excretion)過程，ADME評價是對藥物發現和開發的關鍵步驟。絕大部分中草藥含多達50種甚至上千種化合物，但僅有少數化合物表現出具有潛在生物學效應的ADME特性[14]，因此，迫切需要評估中草藥成分對人體的影響和風險。口服生物利用度(oral bioavailability，OB)是指藥物有效成分被機體吸收并發揮作用的速率和程度，是對藥物篩選中最常見的藥物動力學參數之一[15]。類藥性(drug-likeness，DL)是指化合物與已知藥物在官能團以及物理性質上的相似性[16]，DL越大則認為該化合物與已知藥物的相似性越高，通常以DL≥0.18為篩選標準[17]。本研究以OB≥30%、DL≥0.18作為篩選條件。

1.2 方法

1.2.1骨碎補作用靶點預測：Swiss數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)可基于分子的2D和3D結構與已知配體的相似度準確預測活性成分的靶點[18]。將SMILES依次輸入Swiss，以“人類”為研究物種，整合去重得到骨碎補的作用靶點。

1.2.2疾病靶點獲取：通過Disgenet數據庫(http://www.disgenet.org/)檢索“Osteoporosis”得到OP的相關基因及靶點蛋白。與上述作用靶點相映射，得到骨碎補治療OP的潛在靶點。

1.2.3構建“骨碎補-活性化合物-潛在作用靶點”網絡：將上述活性化合物和潛在靶點導入Cytoscape，繪制“骨碎補-活性化合物-潛在作用靶點”網絡。節點(note)代表骨碎補、活性化合物和潛在靶點，邊(edge)展現了三者的聯系。通過“Network Analyzer”插件對網絡進行拓撲分析，根據節點連接度(degree)和介數中心性(betweenness centrality)設置網絡樣式，節點大小反映degree大小，邊的粗細反映betweenness centrality大小。

1.2.4構建蛋白質相互作用網絡：String數據庫 (search tool for the retrieval of interacting genes，http://string-db.org/)收集了大量通過實驗檢測和生物信息學方法得到的蛋白相互作用關系，共涉及9 643 763個蛋白和1 380 838 440個相互作用[19]。將骨碎補治療OP的潛在靶點導入String，物種選“人類”，獲取蛋白相互作用信息，把note1、note2和Combine score信息導入Cytoscape繪制蛋白相互作用網。

1.2.5靶點的生物功能及通路富集分析：DAVID數據庫 (database for annotation,visualization and integrated discovery，https://david.ncifcrf.gov/)是一個高通量生物學信息注釋數據庫，能為大規模的基因或蛋白提供系統全面的生物學功能注釋信息，進而挖掘其生物學意義[20]。將骨碎補的潛在靶點導入David數據庫，物種限定“人類”，進行GO生物過程(gene ontology - biological process)和KEGG Pathway富集分析，篩選P<0.01的生物過程及P<0.05的信號通路，用Origin 2018繪圖。

2 結果

2.1 骨碎補的活性成分及其分子結構

共收集到骨碎補的化合物71個，根據OB≥30%，DL≥0.18篩選得到18個活性成分(表1)。

表1 骨碎補的潛在活性成分及其OB、DL值和分子結構式Table 1 Potential active compounds in Drynariae Rhizoma with OB and DL parameters and Canonical SMILES

2.2 骨碎補抗OP的潛在靶點

將Swiss數據庫得到的預測靶點合并去重共得到141個預測靶點；檢索Disgenet數據庫得到OP疾病靶點464個;相映射得到骨碎補抗OP的潛在靶點24個(MMP1、CA2、ESR2、HSD17B1、ALOX12、NR3C1、CYP17A1、CYP1B1、HSD11B1、UGT2B17、ALOX15、AR、NOS3、ESR1、MMP13、LDLR、ERBB2、ABCB1、CYP19A1、CYP1A1、MMP2、STAT1、TRPV4、TRPV1)。見表2。

表2 骨碎補治療OP的活性成分及潛在作用靶點Table 2 Active ingredients and key targets of Rhizoma Drynariae in treating OP

2.3 “骨碎補-活性化合物-潛在作用靶點”網絡

將活性化合物和潛在靶點導入Cytoscape，得到“骨碎補-活性化合物-潛在作用靶點”網絡，見圖1。結果表明，成分豆甾醇(stigmasterol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、黃烷酮(Eriodyctiol (flavanone))、山奈酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、圣草酚(eriodictyol)和環木菠蘿烷醇(cycloartenone)能與5個以上靶點連接，是骨碎補抗OP的主要成分；靶點CYP19A1與成分連接次數為8次，對骨碎補抗OP具有重要意義； CYP1B1為4次，MMP1、CA2、CYP17A1、ESR1、MMP13、LDLR、CYP1A1、MMP2均為3次，對骨碎補抗OP有較大意義。

圖1 “骨碎補-活性化合物-潛在作用靶點”網絡(六邊形節點：骨碎補；菱形節點：活性化合物；圓形節點：潛在靶點。節點大小代表其degree值大小，線條粗細代表betweenness centrality的大小)Fig.1 Active components- potential targets network of Drynariae Rhizoma (Hexagon node: Drynariae Rhizoma; rhomboid node: active compound; circular node: potential target. Node size represents its degree value size, and line thickness represents the size of betweenness centrality)

2.4 蛋白相互作用網絡分析

將String數據庫得到的蛋白相互作用信息(note1、note2和Combine score)導入Cytocape繪制蛋白相互作用網(圖2)。圖中包含23個節點和136條邊(其中TRPV4與其他蛋白沒有邊連接，故不在蛋白相互作用網中體現)，拓撲結構分析結果(表4)顯示： 蛋白ESR1、CYP19A1、CYP1A1、ERBB2、AR、NR3C1、NOS3、CYP17A1、HSD17B1、MMP2的degree值均大于中位數6，認為其在骨碎補抗OP中起重要作用，其中靶點ESR1的degree值在中位數的2倍以上，可能為骨碎補抗OP的關鍵靶點。

圖2 蛋白相互作用網(節點大小代表degree的大小，邊的粗細反映combine score的大小)Fig.2 Protein interaction network (node size represents the size of the degree, and the thickness of the lines reflects the size of the combine score)

序號潛在靶點節點連接度(degree)1ESR1142CYP19A1113CYP1A1114ERBB295AR96NR3C197NOS388CYP17A189HSD17B1710MMP2711ESR2612UGT2B17613CYP1B1514MMP1515HSD11B1516MMP13317ALOX12218STAT1219TRPV1220LDLR221CA2222ABCB1223ALOX151degree中位數6

2.5 GO生物過程分析和KEGG通路富集分析

GO富集結果顯示(圖3)，24個潛在靶點主要參與了oxidation-reduction process(氧化還原過程，8個靶點)、positive regulation of gene expression(基因表達正調控，5個靶點)、steroid metabolic process(類固醇代謝，4個靶點)、transcription initiation from RNA polymerase II promoter(RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄起始，4個靶點)等生物學過程，表明骨碎補可通過多個生物學過程治療OP；KEGG富集結果顯示(見圖4)，骨碎補治療OP主要涉及Metabolic pathways(代謝通路，9個靶點)、Steroid hormone biosynthesis(類固醇激素生物合成，7個靶點)、Ovarian steroidogenesis(卵巢類固醇生成，6個靶點)、Pathways in cancer(癌癥通路，5個靶點)等通路，表明骨碎補可通過各通路協同發揮作用。

3 討論

隨著人口老齡化社會的快速發展，OP已在全球蔓延并成為重要的公共衛生疾病。抗OP藥物的長期使用，尤其是雙膦酸鹽產生的胃腸道反應、肌肉骨骼、下頜骨壞死等不良反應逐漸被重視[21]，治療OP的新藥仍在不斷探索與研發中[22]。腎藏精主骨，腎精的盛衰決定骨的生長發育及衰弱。OP屬中醫學“骨痿”范疇，治當補腎為先。骨碎補長于補腎強骨，是治療骨病的要藥。文獻[23-25]報道骨碎補在臨床實踐中具有抗OP作用。

本研究篩選出骨碎補的活性成分18個、潛在靶點24個和相互關系55個，涉及4條主要通路以及4個主要生物過程。“骨碎補-活性化合物-潛在靶點”網絡顯示，豆甾醇、β-谷甾醇、山柰酚、柚皮苷、圣草酚等有效成分能協同作用于多個靶點，顯示了骨碎補抗OP具有多成分、多靶點的特點。Song等[27]研究表明柚皮素可降低骨轉換標志物的水平、增加股骨強度和預防骨小梁微結構惡化。Pang等[28]發現柚皮素在促進成骨細胞增殖分化的同時可影響骨保護素(osteoprotegerin, OPG)的分泌，抑制破骨細胞的形成。另有研究[29]表明，柚皮素可改善血管內皮因子和VEGFR-2的表達，促進骨骼血管的生成。Chiou等[30]發現山奈酚能通過增強堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的活性，上調骨鈣素、骨橋蛋白、Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達，誘導骨結節形成，以此促進成骨細胞的分化增殖。

圖3 骨碎補治療骨質疏松潛在靶點的GO生物學過程富集分析Fig.3 Enriched gene ontology terms for GO biological processes of key targets from active ingredients of Drynariae Rhizoma

圖4 骨碎補治療骨質疏松潛在靶點的KEGG信號通路富集分析Fig.4 Enriched KEGG pathways of key targets from the main active ingredients of Drynariae Rhizoma

蛋白質相互作用網絡表明骨碎補的靶蛋白之間并非單獨發揮作用，而是一個復雜交錯的網絡。這些靶點的共同作用、共同調節可能是骨碎補治療OP的機制。其中ESR1編碼雌激素受體(estrogen receptor, ER)蛋白。臨床上，作用于ER的選擇性雌激素受體調節劑(selective estrogen receptor modulator, SERMs)被廣泛地應用于絕經后骨質疏松癥并取得良好療效[31]。 Pang等[28]證實了柚皮素通過雌激素受體(ER)-依賴途徑，激活在UMR 106成骨樣細胞中ERα磷酸化，從而發揮成骨作用。這些文獻報道與本文中預測的ESR1靶點一致，說明了本文的預測靶點具有可靠性。另有文獻[32]在雌激素相關的基因多態性與絕經后婦女骨密度之間的潛在聯系的研究中，提示CYP1A1細胞的CG單倍型可能在OP的發病機制中起到重要作用，但其分子機制仍有待探究。同時表4中CYP1A1的degree值為11，暗示其可能為骨碎補發揮作用的主要靶點。另外，CYP19A1、ERBB2、AR、NR3C1這4個靶點的degree值大于9，這為骨碎補治療OP的分子作用基礎給出了新的預測，為進一步研究提供了新線索。

KEGG富集分析表明，骨碎補治療OP主要涉及的通路有代謝通路、類固醇激素生物合成、卵巢類固醇生成、癌癥通路等。有研究[33]表明，23.5%的男性和18.2%的女性患有骨質疏松性非椎體骨折，在代謝綜合征患者中的發生率顯著升高。肥胖、血脂異常、高血糖和高血壓等代謝異常狀態是與OP發生有關的因素[34]。實驗[35-38]表明，上述狀態下的小鼠皮質骨骨密度、骨骼強度、骨鈣素和骨鎂含量均出現下降。慢性低度炎癥是肥胖的一個標志，其特點是在全身循環中大量分泌各種炎癥標志物。高水平的促炎細胞因子通過激活NF-κβ受體激活因子配體(receptor activator of NF-κβ ligand, RANKL)/ NF-κβ受體激活因子(receptor activator of NF-κβ, RANK)/OPG途徑刺激破骨細胞分化和骨吸收[39-40]。研究表明[41]，糖尿病小鼠腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor - α, TNF-α)、巨噬細胞集落刺激因子和RANKL的mRNA表達顯著升高，導致骨形成和骨強度下降。糖尿病晚期的糖基化終產物(advanced glycation end products, AGEs)的積累也會導致骨質量和強度低下[42]。高血壓和OP都與鈣代謝異常相關，高血壓與高氯化鈉攝入量有關[43]，由于腎近端鈣離子與鈉離子的競爭，導致尿鈣排泄增加[44]。

代謝通路和OP的聯系與循環的“葡萄糖-礦物質-皮質激素”相關[45]，這就涉及另外兩條通路：類固醇激素生物合成和卵巢類固醇生成。研究[46]發現，雌激素水平降低是絕經后骨質疏松癥的最強風險因素之一。雌激素缺乏會增加血清RANKL水平，使得許多抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP) 陽性破骨細胞在股骨組織中形成和活化[47]。黃體期缺陷和孕酮水平的降低亦會導致骨丟失[48]。研究[49]表明，雄激素水平在絕經期過渡期間會降低，并可能導致骨質流失。國外一項對于老年男性的研究[50]表明，雌激素主要調節骨吸收，而雌激素和睪酮均可維持骨形成。GO富集結果顯示，骨碎補對OP的影響主要通過氧化還原過程(8個靶點)，基因表達的正調節(5個靶點)，類固醇代謝過程(4個靶點)，RNA聚合酶II啟動子的轉錄起始(4個靶點)等發揮作用，在上述闡釋中亦有體現。

綜上，網絡藥理學結果顯示骨碎補的18個活性成分作用于24個潛在靶點，涉及多種過程、分子和通路，體現了骨碎補多成分、多靶點、多途徑的作用特點。基于網絡藥理學分析藥物與疾病靶點的相互網絡關系能有效地揭示骨碎補抗OP的可能機制，其多成分、多靶點、多途徑的特點也體現了中醫學“天人合一”的整體觀念和辯證論治等理論特色，對中醫藥的推廣運用有一定參考價值。