GLP-1受體激動劑利拉魯肽對糖皮質激素性骨質疏松大鼠的療效和作用機制研究

楊麗娜 楊靖 李娜 潘天榮 鐘興

安徽醫科大學第二附屬醫院內分泌科，安徽 合肥 230601

骨質疏松癥是一種以骨量減少、骨微結構破壞、骨脆性增加和骨折危險性上升為特征的代謝性骨疾病。隨著世界人口老齡化的進程進一步加深，骨質疏松癥的發病率越來越高。由于在骨質疏松的基礎上發生骨折的風險增加，全球范圍內估計，與骨質疏松相關的骨折發生率在老年婦女中約為40%，男性約為13%[1]。其所導致的疼痛和骨折嚴重影響了患者的生活質量，而且給家庭和社會造成了極大負擔，因此骨質疏松已成為世界性難題。糖皮質激素由于其抗炎和免疫抑制作用，在臨床上得到廣泛運用。皮質類固醇治療過程中引起骨保護素(OPG)與核因子κB受體激活因子(RANK)配體(RANKL)之間的比例發生改變，導致在前3～6個月時骨吸收增加，使其發生骨質疏松并增加骨折的風險的不良反應特別突出[2]，糖皮質激素性骨質疏松已躍居至繼發性骨質疏松的首位[3]。

而糖皮質激素也可以通過拮抗胰島素來影響糖代謝過程。近年來，有研究表明骨代謝和糖代謝之間可能存在相互關聯。有研究顯示GLP-1受體激動劑對絕經后骨質疏松具有骨保護作用。但是，關于糖皮質激素誘導的骨質疏松研究較少，因此本研究將討論利拉魯肽作為一種新型降糖藥物，對糖皮質激素性骨質疏松骨代謝的作用與機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級8周齡雄性SD大鼠30只，約(220+10)g，購自安徽省實驗動物中心。飼養環境：標準鼠籠分籠飼養，每籠5只，溫度維持在20～25 ℃，相對濕度45%～50%，通風環境良好，每周更換兩次墊料，自由進食鼠糧和水，飼養期間每周測一次體重，根據體重調節藥物劑量。

1.2 實驗干預藥物及試劑

地塞米松(石藥銀湖制藥有限公司，批號H14022567，規格1 mL:5mg)；利拉魯肽(丹麥諾和諾德公司，批號J20160037，規格3 mL:18 mg)；清潔級大小鼠糧采購于江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司。

1.3 動物分組及造模給藥

所有SD雄性大鼠適應性喂養一周后，測其空腹血糖，隨機分為3組，每組10只：①對照組給予0.1 mL生理鹽水肌肉注射；②地塞米松組按照1 mg/kg[4]劑量配得地塞米松溶液肌肉注射，每周兩次；③利拉魯肽干預組給予地塞米松溶液每周兩次注射的同時，給予利拉魯肽200 μg/(kg·d)[5]皮下注射。利用地塞米松連續干預3月建立糖皮質激素性骨質疏松大鼠模型，并同時給予利拉魯肽皮下注射干預至實驗結束。利拉魯肽組死亡兩只。處死大鼠前測定大鼠空腹血糖，收集大鼠血清、雙側股骨及第五腰椎。雙側股骨及第五腰椎用生理鹽水紗布包裹后置于-20 ℃冰箱內。

1.4 Micro-CT測量骨密度、骨組織微結構、重建圖像

將左側股骨及腰椎室溫下解凍后固定于樣品固定器內，行Micro-CT(SCANCO uCT 80)掃描。掃描條件為：電壓50 kV，電流200 μA，掃描方式 360°旋轉，圖像平面分辨率1024×1024，像素點尺寸15 μm×15 μm，層間距15 μm。掃描完成后，進行組織結構重建。得到重建圖像后，使用自帶軟件定量分析得到骨微結構參數：BMD、TMD、Tb.N、Tb.Th、BV /TV、Tb.Sp、Conn.D。

1.5 股骨生物力學檢測

右側股骨在室溫下解凍后，進行三點彎曲試驗，加載速度為2 mm/min，計算機記錄載荷-位移曲線，然后讀出最大載荷和彈性模量。

1.6 血清骨轉換代謝指標檢測

用試劑盒檢測大鼠血清的TrACP、CTX-I、ALP、OC水平，試劑盒采購于上海源葉生物科技有限公司。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 大鼠的生長情況和FBG變化

干預12周后，地塞米松組大鼠體重較對照組顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)；利拉魯肽組大鼠體重與地塞米松組相比，差異無顯著差異。各組大鼠FBG干預前后差異均無統計學意義，見表1。

項目對照組地塞米松組利拉魯肽組F值P值體重/g448.96±3.91353.55±3.24?341.57±4.3424.72<0.01血糖 /(mmol/L)3.86±0.843.85±0.584.34±0.591.270.30

注：與對照組比較，*P<0.05；與地塞米松組比較，#P<0.05。

2.2 Micro-CT 3D圖、2D切面圖及骨微觀參數

Micro-CT通過對感興趣區域三維重建，得到結果如圖1所示。股骨及腰椎2D切面圖如圖2所示。腰椎骨微觀參數見表2，股骨骨微觀參數見表3。與對照組相比，地塞米松組大鼠股骨和腰椎骨小梁數目減少、形態變細、連續性下降、排列不規則、間距增寬。利拉魯肽干預組的骨小梁變粗變密、骨的連續性好、排列規則成網狀結構，提高了骨小梁的體積分數，并降低骨小梁間距。

圖1 左側股骨及腰椎微型CT 3D圖變化A1:股骨對照組；B1:股骨地塞米松組；C1:股骨利拉魯肽組；A2:腰椎對照組；B1:腰椎地塞米松組；C1:腰椎利拉魯肽組。Fig.1 Changes in micro-CT 3D images for the left femur and the lumbar vertebrae

項目對照組地塞米松組利拉魯肽組F值P值BMD/(mg /cm3)349.83±35.10258.31±28.69?358.47±81.52#4.640.04TMD/(mg /cm3)828.01±16.74776.43±8.44?829.61±19.13#15.590.00BV/TV0.41±0.710.31±0.020.41±0.074.030.05Conn. D/ (1/mm3)110.19±13.7574.80±28.00?111.80±17.08#4.540.04Tb.N/(1/mm)4.48±0.263.68±0.264.87±0.93#4.870.03Tb.Th/mm0.17±0.050.08±0.01?0.15±0.06#4.530.04Tb.Sp/mm0.22±0.110.26±0.02?0.19±0.04#6.890.01BS/BV /(1/mm)25.00±2.6324.42±6.0826.21±3.510.190.83

注：與對照組比較，*P<0.05；與地塞米松組比較，#P<0.05。

圖2 左側股骨及腰椎微型CT 2D切面圖變化A1:股骨對照組；B1:股骨地塞米松組；C1:股骨利拉魯肽組；A2:腰椎對照組；B2:腰椎地塞米松組；C2:腰椎利拉魯肽組。Fig.2 Changes in the micro-CT 2D sectional images of the left femur and lumbar vertebrae

項目對照組地塞米松組利拉魯肽組F值P值BMD/(mg /cm3)282.29±49.02187.57±44.69?280.16±66.08#4.240.04TMD/(mg /cm3)801.97±38.34735.45±26.11?772.37±25.055.010.03BV/TV0.32±0.080.20±0.08?0.24±0.074.830.03Conn. D/(1/mm3)132.38±15.0868.75±11.28?119.28±25.27#15.020.00Tb.N/(1/mm)4.94±0.153.32±0.15?4.19±1.136.870.01Tb.Th/mm0.20±0.060.07±0.01?0.19±0.04#10.740.03Tb.Sp/mm0.20±0.010.30±0.01?0.24±0.094.170.05BS/BV/(1/mm)31.22±5.2133.20±5.2130.10±5.190.500.62

注：與對照組比較，*P<0.05；與地塞米松組比較，#P<0.05。

2.3 股骨生物力學變化

股骨三點彎曲實驗表明，利拉魯肽干預組的最大載荷和彈性模量均高于地塞米松組，各組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

項目對照組地塞米松組利拉魯肽組F值P值彎曲載荷/N167.24±28.25102.03±12.40?139.41±1.16#10.110.01彈性模量/MPa7295.1±835.954262.5±830.86?5789.5±470.60#12.850.01

注：與對照組比較，*P<0.05；與地塞米松組比較，#P<0.05。

2.4 血清ALP、OC、TrACP、CTX-I變化

與對照組相比，地塞米松組大鼠血清骨形成指標ALP、OC 指標顯著下降，骨吸收指標TrACP、CTX-1指標顯著升高。與地塞米松組相比，利拉魯肽組大鼠血清骨形成指標ALP、OC 指標顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，骨吸收指標TrACP、CTX-1指標顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見表5。

項目對照組地塞米松組利拉魯肽組F值P值ALP/(ng/mL)59.86±4.2740.07±2.45?57.59±1.02#101.24<0.001ACP/(μmol/L)43.49±4.2151.65±4.93?44.48±1.63#10.540.001CTX/(pg/mL)10.35±3.39193.31±43.42?21.52±3.41#142.82<0.001OC/(pg/mL)337.20±36.78239.97±30.26?311.28±17.71#23.34<0.001

注：與對照組比較，*P<0.05；與地塞米松組比較，#P<0.05。

3 討論

骨質疏松是一種高發病率的骨代謝性疾病，據估算2006 年我國骨質疏松癥患者已近7 000萬，骨量減少者超過 2億人[6]。而糖皮質激素性骨質疏松已躍居繼發性骨質疏松的首位。我國上海及浙江地區風濕性免疫病患者的GIOP患病率達39%，國外亦有研究數據表明，長期接受糖皮質激素治療患者中，超過10%診斷骨折[7]。因此，GIOP的研究越來越受到重視。當前治療上以抗骨吸收藥物為主，如雙膦酸鹽和降鈣素，而促進骨形成的藥物很少。因此，尋找骨質疏松新的治療藥物顯得尤為必要。

利拉魯肽是人工合成的胰高血糖素樣肽1受體激動劑，目前臨床上作為一種新型的2型糖尿病降糖藥物使用。近年來一項囊括16項RCTs的Meta分析表明，利拉魯肽作為降糖藥在治療糖尿病病人時，病人發生骨折的風險降低(OR=0.38)[8]。此Meta分析顯示利拉魯肽可能同時對骨代謝和糖代謝產生正面影響。此外，Iepsen等[9]的一項隨機對照研究顯示：在37位體重指數大于34 kg/m2的肥胖婦女中使用利拉魯肽持續皮下注射52周后，骨形成增加16%，并且有效的避免了低熱量飲食造成的骨量丟失。另外，受體敲除動物實驗也表明GLP-1在骨代謝中必不可少，敲除GLP-1R的雄性小鼠進行三點彎曲實驗、定量X射線顯微攝影、Micro-CT等檢查，結果顯示缺失GLP-1R的動物的最大載荷，斷裂載荷，剛度顯著降低，骨皮質和骨外徑降低，骨強度下降[10]。動物實驗模型表明，卵巢去勢骨質疏松小鼠模型中，GLP-1受體激動劑利拉魯肽和艾塞那肽分別干預4周后和去勢小鼠相比，利拉魯肽及艾塞那肽都可以明顯改善骨小梁體積、厚度和數量，增加其連接性，以利拉魯肽作用更為明顯[11]。以上研究說明了GLP-1受體激動劑與骨代謝有著密切關系。但未見有GLP-1受體激動劑與GIOP的相關報道。

骨代謝評價包括兩個主要方面：骨量和骨質量。骨量最常用的有效指標為骨密度。同時骨密度也是診斷骨質疏松的必要條件。微型CT是一種非侵入性的對骨質的微觀結構評估手段，其不僅可以進行三維立體重建從而精確、直觀的觀察，還可以對松質骨骨小梁及皮質骨形態進行骨結構參數測量，為骨質疏松程度提出準確的定性及定量資料[12]。本研究通過微型CT測量得到地塞米松組的大鼠股骨和腰椎骨密度明顯下降，證明造模成功。而利拉魯肽可提高GIOP大鼠股骨和腰椎的骨密度。骨質量包括分子水平的骨材料構成、組織水平的骨顯微構筑和骨微結構的完整性。Mansur等[13]的研究表明，鏈脲霉素造模的糖尿病小鼠在利拉魯肽干預21 d后，處死行微型CT檢查，發現糖尿病小鼠的BV/TV、Tb.N呈下降趨勢，但差異無統計學意義。利拉魯肽干預后無明顯變化。考慮與藥物作用時間過短，尚未對于骨微觀參數造成影響。有研究[14]表明，利用艾塞那肽-4干預卵巢去勢骨質疏松大鼠模型16周后，行微型CT檢查發現其股骨和腰椎的BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp、Conn.D較地塞米松組明顯上升，與本實驗的結果相符合，利拉魯肽干預下GIOP大鼠后，大鼠的BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D與地塞米松組相比呈上升趨勢，提示骨小梁微結構得到改善。

骨生物力學中骨結構力學指標測試是評價骨質疏松性骨骼骨折風險最為直接的方法，是骨強度、骨結構、骨量的綜合體現，而單純的骨組織形態學觀察、骨密度測定并不能全面反映骨質量，以力學性能指標評價干預治療骨質疏松藥物的療效是其他測定方法無法取代的[15]。本課題進行的股骨三點彎曲實驗提示地塞米松組大鼠的最大載荷和彈性模量是明顯低于對照組的，而利拉魯肽干預后，可以明顯改善大鼠骨組織的抗骨折能力。這與既往文獻報道缺乏GLP-1受體的小鼠的骨生物力學指標明顯下降相一致[16]。

血清CTX-1是骨中I型膠原的降解產物，它的特異結構保護其不受腎臟降解，在血清中穩定性好。檢測血清CTX-1的含量能特異性反應破骨細胞的吸收活性。TrACP主要由破骨細胞釋放產生的非膠原蛋白，它和膠原代謝產物一起被分泌到細胞外，故TrACP與骨吸收水平成正相關。有研究[17]表明，利拉魯肽干預4周，可降低2型糖尿病大鼠血清CTX-1以及TrACP水平。與本實驗研究結果符合，提示利拉魯肽可抑制破骨細胞活性，通過減少骨量丟失起到保護骨組織作用。成骨細胞可分泌骨特異性堿性磷酸酶，是總堿性磷酸酶的重要組成部分，可反映骨形成的狀態。OC是骨基質中含量最豐富的標志物，由成骨細胞釋放到細胞外，反映骨形成狀態。有研究表明，GLP-1受體表達在成骨細胞中且增加1型膠原蛋白表達和堿性磷酸酶活性，促進骨的合成代謝[18]。此外，Sun等[19]的研究發現，給予一種非肥胖且自發在出生早期出現高血糖的GK大鼠皮下注射利拉魯肽4周后，大鼠不僅骨密度得到提升，其骨形成標志物OC、ALP、collagen 1的表達也顯著增高。與本動物實驗上述實驗結果相一致。提示利拉魯肽可能促進成骨細胞活性，增加促進骨的形成起到保護骨組織的作用。

綜上所述，利拉魯肽能提高骨密度和骨強度，改善骨組織微結構，機制可能與促進骨形成和抑制骨吸收有關。本實驗后續將進一步研究利拉魯肽影響GIOP的機制。