高頻右心房起搏建立犬心房顫動模型和植入式心電監測器的評估

趙璐露，華寶桐，陳麗玲，蒲里津，代榮俗，徐永玄，郭 濤，趙 玲*

(1.昆明醫科大學第一附屬醫院，昆明 650032； 2.昆明醫科大學，昆明 650500；3.云南省阜外心血管病醫院，昆明 650106)

心房顫動是臨床上最常見的快速性心律失常，由于心房喪失了有效的舒縮功能，導致患者生活質量下降、繼發導致心力衰竭、心律失常性猝死和缺血性腦卒中等疾病[1]，其具有很高的發病率及死亡率[2]，已成為嚴重威脅人類健康的慢性非傳染性心血管流行病。隨著基礎和臨床研究的不斷深入，心房顫動的診治能力得到顯著提高，發生和發展機制也逐漸被闡明，但房顫的診療仍不容樂觀，導致了對房顫機制及新療法的研究迫在眉睫。為了更好更全面的深入研究心房顫動的發生機制，穩定的心房顫動動物模型的建立對于研究心房顫動的機制以及治療方法有重要的意義。

本研究中通過心房快速起搏的方法建立穩定的慢性心房顫動的動物模型，在建立模型的過程中，借助SelectSecure系統，將直徑僅為4.1 Fr的細雙極實心電極導線3830主動固定電極建立心房快速起搏系統[3]，同時運用植入式心電監測器，檢測、記錄心房顫動的發生，提高高頻起搏建立心房顫動模型的效率。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

12只SPF級成年比格犬，年齡為7～12個月，雌雄不限，體質量12～16 kg，由昆明醫科大學實驗動物中心提供(購自重慶市中藥研究院實驗動物研究所[SCXK (渝)2012-0006])。動物飼養于昆明醫科大學動物實驗中心比格犬飼養動物房[SYXK (滇) K2015-0002]，常規飲食，光照保持晝夜節奏各12 h，溫度控制在20℃～25℃，相對濕度控制在50%～70%。本研究獲得昆明醫科大學動物實驗倫理審查委員會審核批準(倫理批準號：KMMU2018022，批準時間：2016年1月)。遵循國家衛生研究院實驗動物護理和使用概述的指導原則，按照實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

實驗用比格犬隨機分為空白對照組(6只)和心房顫動模型組(AF組，6只)，所有的犬在術前使用電推剪備皮，備皮部位包括雙側頸部、雙側腹股溝區、前胸部、腰背部L2～3區及四肢。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉(美國Fluka公司進口分裝)；甲醛(上海生工生物)；戊二醛(上海生工生物)。房顫模型起搏器(中國陜西秦明公司)；8631起搏系統程控儀(中國陜西秦明公司)；SelectSiteTM鞘管系統(美國美敦力公司，C304 S-59)；SelectSecureTM電極導線(美國美敦力公司，3830-59 cm)；植入式心電監測器Reveal LINQ(美國美敦力公司)；Vivid q型彩色多普勒心臟彩色超聲診斷儀(美國GE公司)；體表12導心電圖儀(美國Marquet)；普通光鏡Olympus-CX31(日本奧林巴斯公司)；電鏡(日本株式會社)。

1.3 實驗方法

1.3.1 建立犬右心房快速起搏系統

對進行心房顫動模型制備的實驗犬(AF組)進行常規備皮后，側臥于導管床上，給予鼻導管維持低流量吸氧，以3%戊巴比妥鈉30 mg/kg靜脈麻醉，以每小時2 mg/kg維持麻醉。在手術過程中，持續監測體表標準肢體導聯心電圖，心率，血壓氧飽和度等生命體征指標。在無菌操作下,穿刺右側頸外靜脈，送入配套長100 cm的“J”型導引鋼絲至下腔靜脈，將SelectSiteTM鞘管系統組裝完成，沿導引導絲送入右心房，而后導引導絲緩慢地移除，鞘管使用肝素水進行沖洗，將直徑僅為4.1 Fr的細電極導線準確插入止血閥，推送電極導線至螺旋進入鞘管頂端的黑色Mark標記處，旋轉3830螺旋電極，將其在高位右心房處定位并固定鞘管，緩慢推進電極導線直至螺旋環超出導管2～3 cm并接觸到心房肌壁，以順時針的方向將電極導線旋轉3～4圈，X線透視下確認導線固定，測試起搏電極參數(包括閾值、脈寬、感知、阻抗等)，參數滿意后撤出鞘管并固定電極導線；將電極與起搏器連接,將埋藏式高頻率(頻率90～810次/min)房顫模型起搏器埋藏于頸前外側的囊袋內(圖1)。確認生命體征正常后，術后注射青霉素800 000 U 3 d，預防感染。空白對照組實驗犬不建立犬右心房快速起搏系統。

1.3.2 心房顫動動物模型的建立

術后進行心房顫動模型的建立，運用體外起搏器系統程控儀將高頻房顫模型起搏器程控為AOO起搏模式，設置起搏器的輸出、脈寬，均為所測閾值的兩倍。將起搏器的基礎刺激頻率從90次/min起始設置，觀察實驗犬呼吸、心率、飲食等基本狀況，是否出現心衰的相關癥狀及其他異常征象，當實驗犬呼吸急促，聽診心率快，不思飲食，四肢冰涼等情況時，多考慮實驗犬出現心衰癥狀。根據實際情況，持續性或間斷性地進行右心房高頻起搏，逐步調整起搏刺激頻率，每次增加幅度為10～20次/min，每周分別描記一次標準肢體導聯心電圖,程控心臟起搏器起搏狀態，結合植入式心電監測器Reveal LINQ追蹤器所記錄數據，高頻起搏直至關閉房顫模型起搏器起搏功能后，可在不需要心房程序性刺激誘發下，通過所記錄的標準肢體導聯心電圖，當心電圖表現為P波消失，代之以大小、形態及時限均不規則的顫動波，心室律不規整時，提示出現心房顫動[4]，判定房顫模型建立成功，持續時間大于15 min的房顫定義為持續性房顫[4]。

1.3.3 Reveal LINQ追蹤器的植入

AF組實驗犬植入心電監測器Reveal LINQ。實驗犬呈仰臥位，常規在前胸部消毒，進行鋪巾，定位于胸部第四至第五肋間,于胸部正中線左緣2 cm，與胸部正中線呈45°夾角，定位成功后，利多卡因進行局部麻醉，以特質手術刀切開皮膚，使用分離工具分離皮下組織形成植入通路，最后以植入心電監測器配套注射工具注入心電監測器Reveal LINQ(圖2)。術后進行程控，設置追蹤器工作參數,將“AT/AF Detection”設置為“AF Only”，記錄AF負荷。

注：A：實驗犬仰臥于手術臺上，將植入部位定位于胸部第四至第五肋間,正中線左緣2 cm；B：以特質手術刀切開皮膚；C：使用分離工具分離皮下組織；D：使用分離工具分離皮下組織后形成植入通路；E：用配套注射工具注入植入式心電監測器Reveal LINQ；F：成功植入心電監測器Reveal LINQ。圖2 Reveal LINQ追蹤器的植入Note. A, The experimental dog was supine on the operating table. The implantation site was located between the fourth and fifth ribs of the chest, 2 cm from the left margin of the median line. B, A skin incision was made with a special scalpel. C, The subcutaneous tissues were separated with a separating tool. D, An implantation pathway was formed after the subcutaneous tissues were separated by a separating tool. E, The implanted ECG monitor, Reveal LINQ, was injected with matching injection tools. F, The Reveal LINQ was successfully established.Figure 2 The implantation of Reveal LINQ

1.3.4 超聲心動圖的檢查

入選實驗的比格犬在術前均進行超聲心動圖的檢查(采用心臟彩色超聲顯像儀，探頭發射頻率2.5 MHZ)，AF組的實驗犬分別在房顫模型成功建立后、處死前進行超聲心動圖檢查；對照組實驗犬均進行同期超聲心動圖檢查。在心尖四腔切面測量雙心房面積，取3～5個心動周期測量參數，取平均值。

1.3.5 處死實驗犬并采集組織標本

處死兩實驗組實驗犬后，于其胸部正中線，逐層開胸，取出心臟，分離采集左心房組織標本備檢。進行形態學光鏡觀察的標本以10%甲醛固定，制作石蠟切片；進行形態學電鏡觀察的標本以2.5%戊二醛固定，用于電鏡切片觀察，進行免疫組化檢測的標本用4%多聚甲醛固定。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 實驗整體情況

整個實驗中共納入12只犬，在建模過程中死亡2只，其余10只實驗犬完成實驗。AF組實驗犬均成功植入高頻率房顫模型起搏器建立房顫模型系統，并均植入心電監測器Reveal LINQ。在AF組建立房顫模型過程中，有2只實驗犬在建模過程中猝死，根據Reveal LINQ追蹤器數據提示，發生室性惡性心律失常。空白組6只犬均存活。

2.2 心房顫動建模中房顫誘發時間及建模成功率

AF組成功植入高頻率房顫模型起搏器，在可無需心房程序性刺激，自身出現心房顫動(圖3)。建立成功誘發出心房顫動的時間為(10.63±2.13)周；房顫模型建立成功時，在AOO起搏模式下，高頻房顫模型起搏器心房刺激頻率為(588.75±11.26)次/min。

2.3 植入式心電監測器動態追蹤記錄房顫負荷的比較

通過運用植入式心電監測器Reveal LINQ動態追蹤記錄房顫負荷，用以監測心房顫動的發生的房顫的負荷變化。房顫負荷的定義是AT/AF的總發作時間。當程控為“AF Only”時，AT/AF時間報告的是AF事件時長，即當Reveal LINQ追蹤器程控為“AF Only”時，房顫負荷的定義為AF的總的發作時間[5](圖4)。

在建立的心房顫動模型中，運用該植入式心電監測器動態追蹤記錄房顫負荷，結合描記標準肢體導聯心電圖結果提示，有3只實驗犬為陣發性心房顫動，1只實驗犬房顫負荷可達99.9%，同時行體表心電圖檢查，為心房顫動心電圖表現，提示該實驗犬運用快速心房起搏的方式成功建立心房顫動模型，且呈持續性房顫。

注：A、B：實驗犬術前心電圖，竇性心律；C、D：通過快速心房起搏建立心房顫動模型；E、F：在心房顫動模型建立中，當高頻房顫模型起搏器心房刺激頻率為500次/min時，關閉起搏器后，心電圖呈竇性心律，心動過速，P波高尖；G、H：心房顫動模型建立成功，心電圖表現為P波消失，代之以大小、形態及時限均不規則的顫動波，心室律不規整。圖3 心房顫動模型建立過程心電圖及建模成功后心電圖Note. A and B, Electrocardiograms were performed before the operation of the experimental dogs, showing a sinus rhythm. C and D, Atrial fibrillation models were established by rapid atrial pacing. E and F, In the establishment of the atrial fibrillation model, the atrial stimulation frequency of the pacemaker in the high-frequency atrial fibrillation model was 500 beats per min. After closing the pacing function of the pacemaker, ECG showed a sinus rhythm, tachycardia and peaked P waves. G and H, Atrial fibrillation models were successfully established. The electrocardiogram showed that the P wave disappeared and was replaced by an irregular tremor wave with an irregular size, shape and time limit, and an irregular ventricular rhythm.Figure 3 ECG during and after the establishment of the atrial fibrillation model

圖4 植入式心電監測器Reveal LINQ記錄房顫事件報告Figure 4 Atrial fibrillation events recorded by the implantable ECG monitor, Reveal LINQ

2.4 超聲心動圖檢測實驗犬左心房及右心房面積比較

采用心臟彩色超聲顯像儀，探頭發射頻率2.5 MHZ對入選實驗的比格犬進行超聲心動圖的檢查，經心尖四腔測量左、右心房收縮末期心房面積(圖5)。

注：A：對左心房面積的測量；B：對右心房面積的測量。圖5 超聲心動圖測量左心房及右心房面積Note. A, Measurement of the left atrial area. B, Measurement of the right atrial area.Figure 5 The areas of the left atrium and right atrium were measured by echocardiography

經配對t檢驗，心房顫動建模成功后，AF組實驗犬在房顫模型成功建立后與建模前相比較，左心房面積明顯增大[(8.20±0.83) cm2與(3.80±0.08) cm2相比，P<0.05]；右心房面積增大[(4.52±0.44) cm2與(2.75±0.96) cm2相比，P<0.05](表1)。

經配對t檢驗，AF組實驗犬在房顫模型成功建立后與對照組相比較，左心房面積明顯增大[(8.20±0.83) cm2與(3.72±0.15) cm2相比，P<0.05]；右心房面積增大[(4.52±0.44) cm2與(2.78±0.18) cm2相比，P<0.05](表2)。

2.5 左心房心肌形態學觀察

2.5.1 左心房心肌病理結構的改變

在HE染色切片上，對照組中左心房心肌細胞結構完整，排列整齊，細胞核清晰，規則的纖維網填充與整個心肌細胞；間質內成纖維細胞形狀規則數量適中。AF組中，心肌細胞增大，排列紊亂，細胞核大小不規則，核出現異型改變，部分細胞出現明顯壞死，空泡變性及顆粒樣變性，細胞間質疏松，出現心肌纖維化，有炎癥細胞的浸潤(圖6)。

2.5.2 左心房心肌超微結構的改變

左心房心肌細胞電鏡結果提示對照組左心房肌細胞的肌原纖維節的排列是有序的，核膜內染色質結構表現為正常；AF組左心房肌細胞超微結構明顯異常，肌原纖維節出現了嚴重的退化，細胞核出現嚴重的固縮的現象，同時還可見有細胞的凋亡，內質網出現腫大征象，伴隨著部分肌絲的崩解，肌纖維表現出雜亂無序(圖7)。

3 討論

心房顫動是臨床上最常見的一種心律失常，已成為一種心血管流行性疾病[6-7]。對心房顫動機制的深入研究需要基于心房顫動動物模型進行研究。文獻報道，目前在疾病狀態下的在體動物房顫模型依據不同的制備方法，可根據實施建模方法的不同分為藥物房顫模型[8-10]、創傷房顫模型、電刺激房顫模型、缺血房顫模型、基因工程房顫模型等。在上述的各種房顫模型的建立方法中，高頻心房起搏具有房顫誘發率高，持續時間長，制作方法不復雜，可重復性強，對動物損傷小，可較貼近臨床狀況等特點。

Wijffels等[11]于1995年首次報道了在建立持續性房顫模型時，是通過運用快速心房起搏的方法制作的，將起搏電極置于右心耳，300～600次起搏4～6周制備持續性房顫模型。通過該模型的建立，可動物模型發生心房電重構改變，心房異質性增加，繼而導致房顫易于誘發。Tan等[12]研究報道快速心房起搏最初可誘發出陣發性房顫;當繼續進行心房快速起搏，將會發展成為持續性房顫。

表1 心房顫動建模前與心房顫動建模后左、右心房面積的比較

表2 兩組間左、右心房面積的比較

注：對照組兩圖顯示左心房心肌細胞結構完整，排列整齊，細胞核清晰，規則的纖維網填充與整個心肌細胞。AF組左圖顯示左心房心肌細胞間質疏松，明顯的空泡變性及顆粒樣變性；AF組右圖顯示左心房心肌細胞有明顯細胞間質纖維化改變。圖6 光鏡觀察兩組實驗犬左心房心肌細胞病理結構的改變(HE染色，× 200)Note. Those two pictures of the control group showed that the left atrial myocardial cells in the control group were well organized, with clear nuclei and regular fibrous reticulum filling with intact myocardial cells. The left picture of the AF group showed a larger intercellular space, obvious vacuolar degeneration and granular degeneration of the left atrial myocardial cells, and the right picture of the AF group showed obvious interstitial fibrosis of the left atrial myocardial tissue.Figure 6 Pathological changes in atrial myocardial cells observed under light microscopy. HE staining

注：對照組兩圖顯示左心房心肌細胞的肌原纖維節的排列是有序的，核膜內染色質結構正常。AF組兩圖顯示左心房心肌細胞超微結構明顯異常，肌原纖維節出現了嚴重的退化，細胞核出現嚴重的固縮的現象，有細胞的凋亡，內質網出現腫大征象，伴隨著部分肌絲的崩解，肌纖維表現出雜亂無序。圖7 電鏡觀察兩組實驗犬左心房心肌細胞超微結構改變(× 6000)Note. The two pictures of the control group showed normal arrangement of myofibrillar seqments of the left atrial myocytes and normal chromatin structure in the nuclei. The two pictures of the AF group showed abnormal ultrastructure of the left atrial myocytes in the AF group , as the myofibrillar segments showed serious degeneration, obvious karyopycnosis, cell apoptosis, endoplasmic reticulum delatation disintegration of some muscle filaments, and dissarangement of myofibrils.Figure 7 Ultrastructural observation of the cardiomyocytes of left atria in the two groups of experimental dogs

本研究選用高頻心房起搏建立心房顫動模型，在無需心房程序性刺激的情況下，自身出現心房顫動，在建模過程中運用可操控性較強的系統將直徑僅為4.1 Fr的細雙極電極導線3830主動固定電極精準地植入實驗犬右心房建立快速起搏系統，是建立心房顫動模型的一個創新亮點，它可提高在植入過程中電極導線在心房植入的成功率，能更好的選取起搏部位。

本研究所用的植入式心電監測器，是一種用于記錄皮下心電圖，可自動激活或由患者激活的植入式監測系統。本研究的另一創新亮點是，首次運用該植入式心電監測器在房顫模型建模過程中檢測AF的發生及持續時間，可實時、精確地檢測AF并進行長程監測，保證了實驗數據的客觀性和準確性，其裝置內存，可自動記錄檢測到的心律失常事件，并將心律失常事件圖進行存儲，便于回顧、收集、分析心律失常事件心電圖。在高頻心房刺激建立房顫模型的動物實驗中，運用植入式心電監測器，提高了在無心房程序性刺激誘發房顫的情況下動態檢測房顫的效率。

心房顫動時，發生呈快速而無規律的心房活動，細胞內鈣內流增加出現鈣超載，心房收縮功能受到影響，心房內負荷及壓力增大，最終心房肌纖維被拉伸，使得心房被動性擴大[13]，這一改變為促進房顫的發生提供了結構與病理生理基礎[14]。本研究通過超聲心動圖測量左心房、右心房面積，提示經過右心房快速起搏建立房顫模型后，左、右心房面積增大，心房的擴大提示實驗犬心房肌結構發生重構，這一結構的改變正是心房顫動結構重構的一個重要標志[13]。心房結構重塑是指心房肌的間質組織增生或者纖維化增多，細胞膜的穩定性下降，部分細胞器的結構、形態及數量出現變化[15]。通過對心房顫動模型犬及空白對照實驗犬進行左心房組織切片形態學觀察提示心房顫動實驗犬心房結構發生了重構。

本研究中，在犬心房顫動模型建立中創新性地運用了先進的導管操控系統及精細的電極導線，使房顫模型的建立高效、安全；采用體內心臟追蹤器追蹤房顫發作情況，為建立房顫模型提供了精確、高效的完整記錄。在后續的研究中，將進一步對心房顫動實驗犬的蛋白質組學進行深入研究，以期初篩出可能具有指導意義、敏感性高、特異性好的蛋白質生物分子標記物，同時對應收集臨床標本，將所篩選的目標差異表達蛋白在人體臨床標本中，檢測驗證其表達情況，分析其與臨床表型的關聯性，期望可為臨床治療提供特異性高的蛋白質生物分子標記物，為長遠的臨床治療提供動態監測預后的新靶點。