不同年齡雌性恒河猴腎多模式分子功能影像的觀察

王梓延，何 蕊，謝 飛，林慶鏗，王 嬌，胡建偉，潘興華，朱高紅*，呂龍寶

(1.昆明醫科大學第一附屬醫院核醫學科，昆明 650032； 2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二〇醫院干細胞與免疫細胞生物醫藥國家地方聯合工程實驗室、云南省細胞治療技術轉化醫學重點實驗室，昆明 650032； 3.中國科學院昆明動物研究所，昆明 650223)

恒河猴(rhesus monkey)組織器官結構、生理功能及代謝功能與人相似。人工養殖的恒河猴作為一種高級實驗動物，在醫學和生物學等研究領域應用廣泛[1]。腎是調節體內水鹽平衡的重要器官。目前常用恒河猴進行糖尿病腎病、急慢性腎損傷等腎臟疾病的模型制作，進行臨床治療藥物機制的探索和療效驗證[2-3]。對恒河猴進行腎移植等修復重建相關研究也較多[4]。既往對于實驗恒河猴的影像學研究多以CT為主，而其他影像學方法研究及相關報道資料較少[5-6]。本研究測量雌性恒河猴腎功能形態顯像的相關指標，即腎小球濾過率(glomerular filtration rate，GFR)、表觀彌散系數(apparent diffusion coefficient，ADC)、標準攝取值(standard uptake value，SUV)、CT值等，并進行不同年齡組的比較，探究年齡對雌性恒河猴腎的多種影像學定量指標的影響，為恒河猴腎影像學定量分析研究以及科學實驗方面的應用提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

人工繁殖普通級恒河猴由中國科學院昆明動物研究所提供[SCXK (滇) K2017-0003]，共17只，雌性，年齡范圍為2～26歲，體質量范圍為2.2～9.1 kg。按年齡分為幼年組(2～3歲)、成年組(6～7歲)、老年組(22～26歲)[7]。恒河猴飼養于中國科學院昆明動物研究所[SYXK (滇) K2017-0008]。實驗動物機構認可證書(注冊號：CNAS LA0001)。本研究獲得中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二〇醫院倫理委員會審查批準(批件號：倫審2019-003(科)-01)。恒河猴的飼養及使用過程嚴格遵守《美國公共衛生署人道管理和使用實驗動物政策》[8]，并在實驗動物飼養和實驗過程中按3R原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉(上海化學試劑公司，進口分裝，批號：F20140915)；高锝酸鈉溶液(成都原子高科股份有限公司)；注射用亞錫噴替酸(北京欣科思達醫藥科技有限公司)；PET/CT掃描顯像藥物18F-FDG(生產設備為美國GE公司的MINItrace麒麟回旋加速器，束流能量10 MeV；靶材料為日本產大陽牌H218O(豐度> 98%)；合成器為GE公司的TracerLab FDG、FN型號；合成試劑為德國ABX公司)；BUN、Cre、UA檢測試劑(均由北京利德曼公司提供)。SPECT/CT設備(德國Siemens公司Symbia T16雙探頭SPECT/CT儀，由昆明醫科大學第一附屬醫院核醫學科提供)；磁共振設備(聯影3.0T uMR780磁共振掃描儀，由中國科學院昆明動物所提供)；PET/CT設備(美國GE DiscoveryTMPET/CT Elite，由昆明醫科大學第一附屬醫院核醫學科提供)；AW4.6后處理工作站(美國GE)；全自動生化分析儀(貝克曼AU5821)。

1.3 實驗方法

1.3.1 顯像方法

所有顯像檢查前，以質量分數3%戊巴比妥鈉1 mL/kg(按體質量)進行麻醉。

SPECT腎動態顯像：顯像前充分水化，麻醉恒河猴后常規取仰臥位，探頭靠近置于檢查床下，雙腎及膀胱均置于有效視野內。由肘靜脈“彈丸”式注射99 mTc-二乙三胺五乙酸(99mTc-DTPA)后，動態采集：血流相2 s/幀，共60 s；功能相60 s/幀，共1200 s。能峰140 keV，窗寬20%，矩陣64×64，放大倍數1.5。

磁共振掃描：體部相控陣線圈，對恒河猴行SE-EPI序列DWI檢查。DWI檢查采用單次激發平面回波序列(SE-EPI)。雙側腎軸位DWI成像：TR 3000 ms，TE 57.1 ms，層厚8 mm，層間距1 mm，采集次數(NEX)2，矩陣128×128，b值為800 s/mm2。掃描范圍覆蓋雙腎及腎上腺。

18F-FDG PET/CT掃描：恒河猴禁食至少6 h，麻醉后測量血糖< 8 mmol/L，靜脈注射18F-FDG注射劑量0.3 mCi/kg(按體質量)，安靜休息60～90 min后，使用PET/CT進行掃描。CT采用常規全身螺旋掃描，管電壓120 kV，管電流260 mA，螺距0.561，轉速0.5 s/周，層厚3.75 mm，間隔3.75 mm，矩陣512 × 512，FOV 50 cm × 50 cm；隨后行PET掃描，每個床位采集2.5 min。

1.3.2 圖像處理

腎動態顯像圖像處理：在后處理軟件輸入恒河猴的體長、體重信息以及腎臟深度(通過CT圖像測量獲得)，勾畫雙側腎臟及本底的感興趣區(region of interest，ROI)并采用Gate’s法測定腎小球濾過率(glomerular filtration rate，GFR)。測量并記錄左右腎小球濾過率(GFRL、GFRR)和總腎小球濾過率(GFRtotal)。

PET/CT圖像處理：把圖像數據導入AW4.6后處理工作站對腎的PET及CT圖像進行ROI的勾畫，勾畫ROI時避開腎柱及腎血管。測量并記錄SUVmax、SUVmean、CT值。臟器標準化攝取值計算公式：SUV=局部感興趣區放射性活度(MBq/mL)/注射放射性活度(MBq)/體質量(g)。

磁共振圖像處理：在工作站上進行DWI后處理及測量腎實質的表觀彌散系數(apparent diffusion coefficient，ADC)。處理時避開腎柱及腎血管，設置橢圓形ROI，測得相應數據并記錄。

1.3.3 血液學檢測

所有研究對象均取清晨空腹靜脈血5 mL，標本送往中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二〇醫院檢驗科，采用全自動生化分析儀檢測血液中的尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)、血尿酸(UA)水平。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 腎動態顯像圖像處理結果

采用后處理軟件進行腎動態顯像圖像處理。恒河猴腹盆部99mTc-DTPA腎動態顯像結果如圖1所示。靜脈注射后，腹主動脈上段顯影后2～4 s，雙側腎隱約可見，隨之出現明顯腎影，此為腎內小動脈和毛細血管床的灌注影像。2～3 min后腎影最濃，影像完整，腎內放射性分布均勻，為腎實質影。此后腎影周邊的放射性逐漸降低，而腎盂腎盞部位放射性逐漸增高，輸尿管隱約可見，膀胱影逐漸明顯，在20～30 min，腎影甚至基本消退，大部分影像集中在膀胱里。

注：A：恒河猴99mTc-DTPA腎動態顯像血流灌注相；B：恒河猴99mTc-DTPA腎動態顯像功能動態相。Fr：幀；紅粗箭頭：左腎；紅細箭頭：右腎；紅彎箭頭：膀胱。圖1 恒河猴腹盆部99mTc-DTPA腎動態顯像Note. A, The flow phase of 99mTc-DTPA nuclide renal dynamic imaging in rhesus monkeys. B, The functional dynamic phase of 99mTc-DTPA nuclide renal dynamic imaging in rhesus monkeys. Fr means frame. Thick red arrow indicates the left kidney. Thin red arrow indicates the right kidney. Curved red arrow indicates the bladder.Figure 1 99mTc-DTPA nuclide renal dynamic imaging of the abdomen and pelvis of rhesus monkeys

2.2 恒河猴PET/CT圖像處理及磁共振圖像處理結果

恒河猴PET/CT全身最大密度投影(maximum intensity projection，MIP)圖像如圖2A所示，恒河猴腎SUVmax、SUVmean、CT值測量如圖2B、2C所示；磁共振圖像處理及恒河猴腎ADC值測量如圖2D所示。

注：A：恒河猴PET/CT全身最大密度投影圖像(灰色區域)；B：測量恒河猴腎SUVmax、SUVmean；C：測量恒河猴腎CT值；D：測量恒河猴腎ADC值。B、C中的白色圓圈及D中紅線區域為ROI。圖2 將恒河猴圖像數據導入后處理工作站，勾畫腎PET、CT、MR圖像的ROINote. A, Maximum intensity projection of PET/CT of rhesus monkeys (grey regions). B, Renal SUVmax and SUVmean were measured in rhesus monkeys. C, Renal CT values were measured in rhesus monkeys. D, Renal ADC values were measured in rhesus monkeys. The white circles in B and C and the red area in D show ROI.Figure 2 Rhesus monkey imaging data was imported into the post-processing workstation to sketch the ROI for PET, CT, and MR images of the kidney

2.3 影像學形態功能指標

如表1所示，雌性恒河猴老年組的左右腎小球濾過率(GFRL、GFRR)和總腎小球濾過率(GFRtotal)均顯著低于成年組(t=-2.713，-3.562，-3.397，P<0.05)和幼年組(t=-3.948，-4.990，-6.192，P<0.05)，而成年組和幼年組GFRL、GFRR和GFRtotal三指標間均無統計學差異(t=-0.934，-1.660，-1.685，P>0.05)。

老年組的腎ADC值顯著低于成年組和幼年組(F=53.050，P<0.05)。而成年組和幼年組腎ADC值無顯著性差異(t=-1.038，P>0.05)。

不同年齡組雌性恒河猴間，腎的CT值、SUVmax、SUVmean指標均無顯著性差異(F=0.436，1.356，1.258，P>0.05)。

同一年齡組的雌性恒河猴中，左右兩腎間的GFR、ADC值、CT值、SUVmax、SUVmean指標均無顯著性差異(P>0.05)。

2.4 腎功能血清學指標

如表1所示，雌性恒河猴中幼年組、成年組、老年組三組的血尿素氮(BUN)分別為、(6.10±1.28) mmol/L、(5.72±1.48) mmol/L、(5.37±1.58) mmol/L；三組血肌酐(Cre)分別為(43.00±4.24) μmol/L、(44.2±11.05) μmol/L、(52.14±9.70) μmol/L；三組尿酸(UA)分別為(2.80±3.49) μmol/L、(1.80±1.79) μmol/L、(1.29±0.49) μmol/L，三個指標在幼年組、成年組、老年組三組間均無顯著性差異(F=0.179，1.2，0.762，P>0.05)。

2.5 相關性分析

如圖3所示，相關性分析結果顯示，BUN、Cre均分別與GFRtotal呈現中度相關性(r=0.56，-0.56，P<0.05)。UA與GFRtotal無顯著相關性(P>0.05)。

3 討論

恒河猴是人類的近屬動物，許多生物學特性和人類較為接近。在腎解剖學上，恒河猴與人類不同在于左腎較右腎低約半個腰椎體，而人類的右腎較左腎低[9]。隨著年齡增長，恒河猴腎衰老性變化逐漸明顯。老年猴的腎常常表現為腎皮質變薄，部分腎小球纖維化、玻璃樣變甚至消失；腎間質結締組織增加，腎小球數量減少，腎小管呈現萎縮表現，近曲小管上皮細胞減少而遠曲小管局限性擴張[7]。

CT具有較高的密度分辨率，其利用不同密度組織結構對X射線吸收衰減系數的不同，通過計算機處理，獲得各組織器官結構影像。18F-FDG是一種葡萄糖的類似物，標準攝取值(SUV)是反映18F-FDG在細胞中聚集的半定量指標，反映著細胞組織的葡萄糖代謝情況[10]。本研究采用PET/CT對恒河猴腎進行顯像，觀察解剖結構并測量腎的CT值、SUVmax、SUVmean。結果顯示不同年齡組的雌性恒河猴腎解剖以及其與周圍組織器官的位置關系與文獻[9]報道一致。Meier等人[11]使用PET/CT掃描并評估人腹部器官結構和功能與年齡的相關變化，結果表明人左右腎CT值與年齡均無顯著相關性。本研究顯示雌性恒河猴各年齡組內左右腎間、不同年齡組間，腎CT值均無顯著性差異，結果與人類似。同時Meier等人[11]認為，腎是顯像劑18F-FDG經血液循環系統代謝后主要的排泄器官，限制了使用SUV指標定量評估腎代謝功能的能力。而本研究雌性恒河猴腎SUVmax、SUVmean數值與年齡無顯著相關，亦證實了此觀點。

表1 不同年齡組雌性恒河猴腎血清學、影像學觀察指標

注：與老年組相比，*P<0.05。

Note. Compared with the old group,*P<0.05.

圖3 GFR與BUN、Cre、UA的相關分析Figure 3 Correlation analysis of GFR with BUN, Cre, and UA

磁共振彌散加權成像(diffusion-weighted imaging，DWI)是反映活體組織內水分子布朗運動狀態的磁共振功能成像技術之一。不僅可以通過圖像觀察體內組織、器官的功能狀態，還能通過測量表觀彌散系數(apparent diffusion coefficient，ADC)對組織功能狀態進行定量分析。腎是水轉運的主要場所，為了有效觀察腎臟水分子的布朗運動，本研究采用b值為800進行研究，此時ADC值主要反映水分子的彌散運動[12]。在正常人中，當高b值時，腎實質ADC值隨著年齡增長而下降。本研究雌性恒河猴腎實質ADC隨年齡的變化趨勢與人的變化類似，原因可能是因為腎間質組織纖維化的程度隨年齡增長而逐漸加重，水分子的擴散運動因此減慢[13]。

99mTc-DTPA是一種幾乎全部被腎小球濾過而不被腎小管吸收和分泌的放射性物質，測定其清除率能準確反映腎小球濾過率(glomerular filtration rate，GFR)。99mTc-DTPA SPECT/CT腎動態顯像法測定GFR廣泛用于臨床，可同時獲得雙腎及分腎功能。Gate’s法是腎動態顯像測定GFR時所用的核心方法，如果未對腎深度進行校正，就會對腎功能的定量造成誤差。本研究通過CT圖像實測腎深度獲得校正值，所測恒河猴GFR數據更貼近實際[14-15]。Goyal[16]研究發現在正常成人中，腎小管和腎小球細胞的數量隨著年齡增加而減少。Melk等人[17]認為隨著年齡的增加，腎纖維化激活增加以及細胞凋亡加速也可能導致腎小球硬化和間質纖維化。Jiang等人[18]研究表明腎中與脂質合成和腎膽固醇蓄積相關的某些蛋白的表達隨著年齡的增長而增加，脂質在衰老腎內的蓄積可能導致腎功能的下降。Fardoun等人[19]在衰老的大鼠中，發現腎單位近端小管的多巴胺受體與G蛋白解偶聯，這種解偶聯現象和由此產生的功能障礙可能源于隨著年齡增長而積累的氧化應激反應產物。本研究雌性恒河猴按年齡分組，老年組GFR顯著低于成年組、幼年組，結論與以上研究觀點相符。

有學者指出BUN、Cre等腎血清學指標并不是反映GFR的敏感指標，特別是在老年人群中[20]。本研究相關性分析中雌性恒河猴腎GFR與BUN、Cre相關性不高(均呈中等相關)，而與UA則無顯著相關，也支持此觀點。這可能是由于BUN、Cre、UA易受飲食、蛋白合成、分解代謝及血液容量等多種因素的影響，因而不能準確及時地反映腎小球濾過率的變化[21]。此結論進一步反映了SPECT/CT腎動態顯像在評價腎功能方面優于其它影像學及血清學檢測。

郭菲等人[22]對804個健康人體的生化參數進行檢測，結果表明對于40歲以后的人類女性來說，BUN、Cre、UA水平均隨著年齡逐漸下降。而本研究雌性恒河猴血清BUN、Cre、UA在三個年齡組間均無顯著性差異，可能是由于本實驗恒河猴樣本數目較少，未體現恒河猴各年齡組腎功能血清學指標的差別。針對年齡對生化指標的影響，將在下一階段實驗中加大恒河猴樣本數目加以驗證。

本研究應用多種影像學設備對不同年齡組雌性恒河猴腎顯像并測量相應影像學指標，觀察年齡對雌性恒河猴腎分子功能影像指標的影響。結果充分顯示了分子功能影像對恒河猴腎進行觀察研究的優勢。該研究通過SPECT/CT分子功能影像為恒河猴左右分腎功能定量分析提供參考依據，作為分腎功能“金標準”評價為恒河猴腎相關科學實驗研究提供基礎資料。