KK鼠料快速建模對KK/Upj-Ay/J小鼠相關指標的影響

王 蕾，吳旭穎，高玉龍，梁 超，鄧詩芬，劉云波,2*

(1.北京華阜康生物科技股份有限公司，北京 102202； 2.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京 100021)

KK小鼠是由日本本土小鼠通過近交獲得，隨后日本學者將基因Ay導入KK小鼠體內，KK-Ay小鼠具有黃色的體毛。Ay基因不僅可影響小鼠的毛色還可以引起代謝紊亂，與肥胖和糖尿病的發生有關。KK-Ay小鼠表型接近于人類Ⅱ型糖尿病早期病變的特征，包括過量飲食、中度肥胖、高血糖、胰島素抵抗等，是一種廣泛應用于Ⅱ型糖尿病和肥胖研究的動物模型[1]，此外該小鼠還可用于研究評價降血糖藥及其藥理作用的研究。

國內KK/Upj-Ay/J小鼠的生物學特性早在1988年就有報道[2]，國內有報道指出高能量飲食可以促進KK/Upj-Ay/J小鼠血糖和發病率明顯增加，胰島體積明顯增加[3]。還有報道指出飼料的營養成分是影響血糖的主要影響因素，此外隨著年齡的增長影響其血糖值[4]。高脂飼料常用于快速誘導Ⅱ型糖尿病、肥胖癥，本公司研制的具有專利配方的KK鼠料(ZL201110127312.5)，是根據Ⅱ型糖尿病模型動物KK/Upj-Ay/J小鼠的營養需求設計的高脂高糖飼料，尤其適用于KK/Upj-Ay/J小鼠，可明顯縮短KK/Upj-Ay/J小鼠的成模周期。KK鼠料快速建模對KK/Upj-Ay/J小鼠相關指標的影響卻未見詳細報道。本研究旨在補充這方面的不足。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級3周齡KK/Upj-Ay/J小鼠80只[雌、雄各40只，雄性KK/Upj-Ay/J小鼠平均體重為(9.40 ± 1.22) g，雌性KK/Upj-Ay/J小鼠平均體重為(9.56 ± 1.21) g]，隨機分為4個實驗組，每組20只(雌、雄各10只)，分別為普通飼料組、普通飼料空腹血糖組、KK鼠料組、KK鼠料空腹血糖組。SPF級23周齡C57BL/6 J小鼠6只[雌、雄各3只，雄性C57BL/6 J小鼠體重為(32.33 ± 1.51) g，雌性C57BL/6 J小鼠體重為(29.40 ± 0.73) g]為對照組，飼喂普通飼料。KK/Upj-Ay/J小鼠和C57BL/6 J小鼠均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供[SCXK (京) 2019-0008]。動物實驗程序由北京華阜康實驗動物管理委員會審批確認符合動物倫理學要求和實驗動物保護的相關規定，批準號：IACUC-20190502，實驗動物飼養和實驗過程中做到實驗動物使用的3R原則，并給予實驗動物人道關懷。

實驗KK/Upj-Ay/J小鼠和C57BL/6 J小鼠均飼養在北京華阜康生物科技股份有限公司隔離環境(隔離器)內[SYXK (京) 2019-0022]，隔離環境為潔凈度5級，溫度(24 ± 2)℃，相對濕度(50 ± 10)%，換氣次數為每小時20次，明暗周期為12 h: 12 h，動物自由采食飲水。從3周開始飼喂，飼喂到23周。

普通飼料組動物飼喂小鼠普通繁殖料，為北京華阜康生物科技股份有限公司生產的60Co輻照滅菌的鼠繁殖料1035[京飼證(2019)06076]。營養指標為粗蛋白23.82%、粗脂肪5.16%、粗灰分7.19%、粗纖維4.62%、鈣1.25%、磷0.97%、賴氨酸1.55%、蛋氨酸+胱氨酸0.91%。

KK鼠料組動物飼喂KK鼠料，為北京華阜康生物科技股份有限公司生產的KK鼠料1042[京飼證(2019)06076]，主要營養指標為：蛋白17.5%、脂肪17.9%、碳水化合物48.5%(重量百分比)。

飲用水為酸化過濾自來水(pH=2.7 ～ 3.0)并經高壓蒸汽滅菌30 min(121℃)。使用的籠具、墊料、水瓶等物品均經過高壓蒸汽滅菌30 min(132℃)，每周更換墊料一次，進出隔離器的物品均應進行消毒處理，操作嚴格遵守隔離系統規程。

1.2 主要試劑與儀器

75%乙醇；血糖儀(江蘇魚躍牌)、配套試紙、電子天平、剪刀等手術器械。

1.3 實驗方法

1.3.1 體重的測定

每周用電子天平稱取普通飼料組和KK鼠料組小鼠體重，并做好記錄。

1.3.2 血糖的測定

按照實驗分組每周進行尾靜脈取血3 μL，用血糖儀測量空腹血糖值。空腹血糖需要禁食4 h后再進行檢測。統計不同年齡、不同性別對照組與實驗組的血糖值。

1.3.3 血清生化的檢測

完成飼喂實驗后，普通飼料組和KK鼠料組小鼠均禁食12 h，小鼠采血(每組雌、雄各6只)，室溫放置30 min，離心3000 r/min，分離血漿。送農大動物醫院檢測室檢測生化指標。生化指標包括谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、肌酐(CREA)、尿素(UREE)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)。

1.3.4 切片及染色

用10%中性福爾馬林溶液固定對照組(C57BL/6 J小鼠)、普通飼料組和KK鼠料組雌性、雄性小鼠(每組雌、雄各3只)的胰腺、肝和腎。送北京康藍生物技術有限公司病理室進行HE染色和特殊染色(胰腺進行胰島素免疫組化染色、肝進行PAS染色、腎進行PASM染色)。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 KK鼠料對KK/Upj-Ay/J小鼠體重的影響

由表1可見在4 ～ 23周飼喂過程中，KK鼠料顯著促進雄性和雌性KK/Upj-Ay/J小鼠的增重(P<0.01)。3周時KK/Upj-Ay/J小鼠剛離乳，經過KK鼠料飼喂1周后，顯著增加了小鼠的體重(P<0.01)。

表1 KK鼠料對KK/Upj-Ay/J小鼠體重的影響

注：與同性別同周齡小鼠比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the mice of the same sex and age,*P<0.05,**P<0.01.

2.2 KK鼠料對KK/Upj-Ay/J小鼠空腹血糖值的影響

由表2可見KK鼠料飼喂KK/Upj-Ay/J小鼠能顯著增加雌性和雄性KK/Upj-Ay/J小鼠的空腹血糖值(P<0.05)。但是顯著性差異存在一定的周齡跳躍性，例如對于3周雌鼠、5 ～ 6周雄鼠、7周雌鼠、8周雄鼠、9周雌鼠等的空腹血糖值就沒有明顯的差異(見表2)，可能與小鼠進食時間的隨機性有關。

2.3 KK鼠料對KK/Upj-Ay/J小鼠血清生化指標的影響

由表3可以看出KK鼠料明顯增加血清中谷丙轉氨酶(P<0.05)，顯著增加雄性KK/Upj-Ay/J小鼠血清中膽固醇的含量(P<0.05)，但是對于雌性KK/Upj-Ay/J小鼠血清中膽固醇含量沒有顯著的影響。KK鼠料可顯著增加雌性KK/Upj-Ay/J小鼠血清中肌酐的含量(P<0.05)；此外KK鼠料可增加雄性KK/Upj-Ay/J小鼠血清中總甘油三酯的含量(P>0.05)，但是對于雌性KK/Upj-Ay/J小鼠血清中總甘油三酯的含量影響不大(P>0.05)。

表2 普通飼料或KK鼠料飼喂KK/Upj-Ay/J小鼠空腹血糖數據統計結果

注：與同性別同周齡小鼠比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the mice of the same sex and age,*P<0.05,**P<0.01.

表3 普通鼠料或KK鼠料飼喂KK/Upj-Ay/J小鼠血清生化指標統計結果

注：與同性別小鼠比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the mice of the same sex,*P<0.05,**P<0.01.

2.4 KK鼠料對組織器官組織結構的影響

如圖1所示，飼喂實驗后，取各組小鼠的胰腺、肝、腎進行病理組織切片分析，發現飼喂兩種鼠料對雌雄KK/Upj-Ay/J小鼠胰腺組織結構的影響是相似的，對于雄性的KK/Upj-Ay/J小鼠的胰腺組織沒有明顯的影響，腺泡、導管和胰島結構清晰可見，未見明顯病變。但是對于雌性KK/Upj-Ay/J小鼠胰腺組織有明顯的影響，主要為胰島細胞增多，體積變大[5-6]。免疫組織化學的結果也顯示雌性小鼠普遍存在胰島素分泌量增多的情況，如圖1中C1 ～ F1。

注：A、A1：C57BL/6 J(雌)；B、B1：C57BL/6 J(雄)；C、C1：普通飼料組(雌)；D、D1：普通飼料組(雄)；E、E1：KK鼠料組(雌)；F、F1：KK鼠料組(雄)。A ～ F為HE染色；A1 ～ F1為胰島素免疫組化染色。標尺=100 μm。圖1 兩種鼠料對KK/Upj-Ay/J小鼠胰腺組織結構和功能的影響(× 100)Note. A and A1, C57BL/6 J (female). B and B1, C57BL/6 J (male). C and C1, Common feed group (female). D and D1, Common feed group (male). E and E1, KK feed group (female). F and F1, KK feed group (male). A-F, HE staining. A1-F1, Insulin IHC staining. Bars=100 μm.Figure 1 Histological changes of the pancreatic tissues of KK/Upj-Ay/J mice fed on the two kinds of feeds

兩種鼠料對雌雄KK/Upj-Ay/J小鼠肝組織結構的影響略有不同，兩組肝主要病理變化為肝細胞脂肪變性，KK鼠料飼喂KK/Upj-Ay/J小鼠組脂肪變性程度更加明顯(見圖2中A ～ F)；普通飼料飼喂組、KK鼠料飼喂組肝細胞胞漿呈PAS染色陰性(見圖2中C1 ～ F1)，有報道稱糖尿病KK/Upj-Ay/J小鼠肝中糖原含量明顯減少[7]。而C57BL/6 J小鼠對照組肝細胞胞漿紫紅色為PAS染色陽性反應(見圖2中A1 ～ B1)。

注：A、A1：C57BL/6 J(雌)；B、B1：C57BL/6 J(雄)；C、C1：普通飼料組(雌)；D、D1：普通飼料組(雄)；E、E1：KK鼠料組(雌)；F、F1：KK鼠料組(雄)。A ～ F為HE染色；A1 ～ F1為PAS染色。標尺=100 μm。圖2 兩種鼠料對KK/Upj-Ay/J小鼠肝組織和功能的影響(× 100)Note. A and A1, C57BL/6 J (female). B and B1, C57BL/6 J (male). C and C1, Common feed group (female). D and D1, Common feed group (male). E and E1, KK feed group (female). F and F1, KK feed group (male). A-F, HE staining. A1-F1, PAS staining. Bars=100 μm.Figure 2 Pathological changes of liver tissues in the KK/Upj-Ay/J mice fed the two kinds of feeds

與C57BL/6 J小鼠相比，普通飼料飼喂組、KK鼠料飼喂組腎病理變化主要表現為腎小管蛋白管型，間質性腎炎，血管周圍炎，腎小球系膜基質增多，KK鼠料飼喂組腎病變程度較明顯(見圖3中A ～ F)。C57BL/6 J組腎小球基底膜有明顯深棕色物質沉著，而普通飼料飼喂組、KK鼠料飼喂組腎小球基底膜均未見明顯棕色物質沉著(見圖3中A1 ～ F1)，說明飼喂實驗后期腎小球基底膜結構損壞。

3 討論

KK鼠料可顯著地增加雌性和雄性KK/Upj-Ay/J小鼠的體重，如表1所示(P<0.05)，由于KK鼠料中有較高的碳水化合物(占飼料的48.5%)和脂肪(占飼料的17.9%)，能使KK/Upj-Ay/J小鼠快速增重。而且在飼養實驗后期雌性KK/Upj-Ay/J比雄性KK/Upj-Ay/J體重增加更明顯，本研究與Iwatsuka等人[8]研究雌、雄KK-Ay小鼠在10周和16周的體重，雌性比雄性重的結論一致。此外，該報道稱16周KK-Ay小鼠脂肪組織對胰島素的敏感性降到最低，黃色肥胖基因不僅誘導KK-Ay小鼠肥胖，而且加速了KK-Ay小鼠糖尿病性狀的發育，幼年KK-Ay小鼠脂肪合成的活性很強，由于KK-Ay小鼠的代謝特點，導致體內更容易堆積脂肪，而肥胖誘發糖尿病[8]。

KK鼠料可以顯著增加雌性和雄性KK/Upj-Ay/J小鼠的空腹血糖值，如表2所示(P<0.05)。與郭清華等[3]研究的高能量飲食可使KK-Ay小鼠的血糖和糖尿病發病率明顯增加的結論一致，此外有研究報道指出KK-Ay小鼠的血糖值隨著年齡的增長而增加，到16周有巨大變化[8-9]。國內也有相關研究報道，遺傳背景相同的情況下，飼料中營養成分脂肪的含量可影響KK/Upj-Ay/J品系A/a雜合子小鼠的血糖值[4]。

KK鼠料飼喂實驗后剖檢可見KK鼠料組雌性和雄性KK/Upj-Ay/J小鼠肝脂肪變性，色淺而且肥大，質脆。血清生化指標檢測也顯示谷丙轉氨酶顯著增加(P<0.05)，谷草轉氨酶增加，但是差異不顯著。這與脂肪肝患者ALT、AST指標明顯上升的報道是一致的[10]。從病理切片和肝PAS染色也顯示KK鼠料促進KK/Upj-Ay/J小鼠肝細胞的脂肪變性，促進Ⅱ型糖尿病快速成模，肝細胞PAS染色陰性，與糖尿病小鼠肝細胞PAS染色陰性的報道一致[7]。

兩種鼠料飼喂實驗末期，雌性KK/Upj-Ay/J小鼠胰腺病變發生，胰島細胞增多，體積變大。這與胰島細胞代償性的分泌胰島素有關[3, 8]。但是雄性KK/Upj-Ay/J小鼠卻不同，胰腺未見明顯的病變發生。可能與雄性KK/Upj-Ay/J小鼠生理因素有關，有待進一步研究。日本有學者研究黃化KK-Ay小鼠血糖和循環胰島素水平從5周齡開始逐漸升高，且胰腺也有年齡依賴性改變，即胰島B細胞脫顆粒和糖原浸潤，第一次觀察于5周齡，隨后出現胰島肥大和中央空化[8]。

兩種鼠料飼喂實驗末期，雌性和雄性KK/Upj-Ay/J小鼠均發生糖尿病腎病，腎組織病變為腎小管蛋白管型，間質性腎炎，血管周圍炎，腎小球系膜基質增多。KK鼠料組較普通飼料組肌酐顯著增加，雌性KK/Upj-Ay/J小鼠差異顯著(P<0.05)。腎PASM染色顯示普通飼料組和KK鼠料組飼喂后期腎小球基底膜結構損傷嚴重，可能與糖尿病腎病腎小球基底膜成分改變有關[11]。有報道指出12周齡進入早期的糖尿病腎病(DN)，20周齡腎臟病理表現為特征性DN改變[12]。16周齡的小鼠也發現了類似于人類糖尿病彌漫性或滲出型腎小球硬化病變[8]。還有報道指出KK-Ay小鼠胰島素抵抗和高尿微量白蛋白水平可作為糖尿病腎病早期模型診斷[9]。

本研究進一步探討了高脂料快速建模對KK/Upj-Ay/J小鼠相關指標的影響，為科學研究提供快速建模的數據支持。