樹鼩長途運輸應激期營養干預措施的探究

馮一唯，夏 巍，戢克銅，賴永靜，馮清源，陳泓霖，黃宗健，易 翔，唐安洲

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧 530000)

樹鼩(Tupaiabelanger，tree shrew)是一種形似松鼠的小型哺乳動物，屬哺乳綱、攀鼩目[1]。作為靈長類動物的近親，樹鼩在遺傳特性、生理機能和生化代謝等方面與人類相似,作為人類疾病動物模型具有良好的前景[2-3]，目前樹鼩在腫瘤、糖尿病、傳染性疾病、視覺障礙、心理應激等研究領域都取得了一定的進展[4-8]。在國內樹鼩主要分布于云南、海南、廣西、廣東等熱帶、亞熱帶地區。本課題組長期從事樹鼩相關研究[9-11]，在前期的實驗中我們發現，樹鼩生性膽小易驚，在經過約10 h的長途汽車運輸后，路途中劇烈的顛簸、噪音、擁擠、饑渴、溫度變化、為了保存平衡而不斷運動，多樣的強烈應激源造成了樹鼩生理性和心理性的刺激，由此引起長途運輸綜合應激反應。應激反應激活免疫系統，在呼吸、消化、泌尿系統引起炎性反應，導致能量消耗增加，食量下降，嚴重威脅樹鼩的健康。而此時若僅喂食常規顆粒飼料，極易引起胃腸道積氣和炎性反應，樹鼩進食量少甚至拒食，兩周內死亡率高達40%，珍貴實驗動物資源的損失實為可惜。且應激期動物的代謝、神經內分泌和免疫功能有較大波動[16]，不適宜開展實驗，耽誤實驗進度。因此，如何通過有效的管理和營養干預，使樹鼩安全消退運輸應激成為了急需解決的問題。

目前對于猴、大小鼠等常見實驗動物有可參考的運輸標準和福利措施[12]，但是樹鼩尚無可供參考的標準。樹鼩屬雜食性小獸,喜食小昆蟲、樹膠質、野果等[3]。根據這一特質，我們選擇了顆粒飼料、新鮮果蔬和面包蟲干作為樹鼩的主要食物。本實驗將分為探究樹鼩較為適合的營養干預方法和驗證該方法是否能降低運輸應激對樹鼩的影響兩個部分,以減小運輸應激對樹鼩的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗用中緬樹鼩滇西亞種購自中科院昆明動物研究所，實驗過程處于樹鼩非繁殖期。在第一部分，從目前本課題組飼養時間超過6個月的普通級樹鼩中選擇40只成年雄性樹鼩，平均年齡1歲± 3個月，平均體重(104.7±8.3) g[SCXK (滇) K2017-0014]，既往僅投喂購自中科院昆明動物研究所角建林等[17]研制生產的樹鼩標準飼料。在第二部分，從中科院昆明動物研究所購買普通級成年雄性樹鼩30只，平均年齡1歲± 3個月，平均體重(97.4±11.7) g[SCXK (滇) K2019-0005]。所有樹鼩均飼養于廣西醫科大學實驗動物中心[SYXK (桂) 2014-0003]，飼養溫度(24±1)℃，相對濕度40% ～ 50%，光暗周期12 h:12 h。樹鼩置于樹鼩飼養籠中(長、寬、高分別為35 cm、25 cm、30 cm)單籠飼養，籠具配有食盒及飲水瓶。每籠內設置一木盒供樹鼩睡眠(長、寬、高分別為15 cm、12 cm、12 cm)，木盒側面有一直徑10 cm開口供樹鼩進出活動。本實驗中實驗動物的使用得到了廣西醫科大學動物倫理審查委員會的批準，批準編號為201812030。實驗操作過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

參考既往研究[14]，根據總含糖量(g/100 g食部)將新鮮果蔬劃分為高含糖量(> 10 g/100 g食部，如富士蘋果、雪梨)、中等含糖量(5 ～ 10 g/100 g食部，如溫州柑、桃)和低含糖量(< 5 g/100 g食部，如大白菜葉、黃瓜)三個等級。投喂食物及更換飲用水瓶的頻率為每天一次，時間為8:00 ～ 10:00。面包蟲及標準飼料投喂在食盒中，新鮮果蔬洗凈去皮后，切取食部投至籠中，避免投至食盒或木盒中。

1.2 主要試劑與儀器

4%組織細胞固定液(批號：20181120)，HE染色試劑盒(批號：20181102)均購自索萊寶科技有限公司。樹鼩保定袋[16]由本課題組自行設計制作。Olympus正置光學顯微鏡BX53F購自日本。

1.3 實驗方法

1.3.1 樹鼩的營養干預方法探究

為了探究樹鼩偏好的營養干預方法，實驗的第一部分將分為兩階段。將40只成年雄性樹鼩分為A、B兩組，在第一階段，給予A組三種不同含糖量的足量果蔬：富士蘋果+溫州柑+大白菜葉各100 g/d，給予B組雪梨+桃+黃瓜各100 g/d。同時，給予兩組20 g/d面包蟲干+50 g/d標準飼料作為輔食。在次日投喂之前，先打掃籠具并取出前日未吃完的食物分別稱量并記錄。同時記錄樹鼩狀態，狀態描述包括樹鼩的活動度、是否因大小便失禁而出現“濕尾”、毛發的潤澤和濃密程度等。每3 d對所有樹鼩稱重1次。稱重時，將樹鼩置于保定袋中進行稱重，該保定袋可固定樹鼩頭尾及四肢，便于精確測量。測量完成后將樹鼩放回籠中并測量保定袋的重量，二者相減即可得到樹鼩的體重。所有重量精確到0.1 g。該部分持續15 d，結束后統計出每種新鮮水果、面包蟲干和標準飼料的日平均消耗量和體重變化趨勢。

在第二階段，給予A、B兩組消耗量最多的三種新鮮果蔬各100 g/d，同時A組每只給予面包蟲干20 g/d +標準飼料50 g/d作為輔食，B組僅給予標準飼料70 g/d。如同前一部分記錄各種食物消耗量，并對樹鼩狀態進行描述，每3 d稱量體重1次。該部分持續15 d，結束后統計出每種新鮮水果、面包蟲干和標準飼料的日平均消耗量，以及兩組的體重變化趨勢。

1.3.2 長途運輸應激樹鼩的營養干預及管理方法

該部分實驗的30只成年雄性樹鼩從中科院昆明動物研究所出發，經實驗動物運輸車運送。運抵本課題組實驗動物中心后，立即稱量體重并放入籠內，并隨機分為E、F、G三組。E組每只僅給予樹鼩最喜歡食用的新鮮果蔬100 g/d，F組給予由前一部分實驗得出的營養干預方法，G組每只僅給予標準顆粒飼料100 g/d。記錄各組各種食物的日消耗量，并對樹鼩狀態進行描述，每3 d稱量體重1次。該部分實驗持續30 d，結束后計算各組生存率(s)和體重變化趨勢并進行比較。實驗過程中若發現樹鼩死亡，及時對其進行解剖，觀察是否有胃腸道積氣積液、腸梗阻等情況，并拍照留存。隨后切取樹鼩胃部、小腸、闌尾、大腸等組織并放置于4%組織細胞固定液中，對固定好的組織進行包埋及切片，并使用HE染色試劑盒對組織切片進行染色，顯微鏡下觀察是否有炎性細胞浸潤。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 穩定期樹鼩的進食偏好，進食量和體重變化

圖1顯示了A、B兩組樹鼩新鮮果蔬的日均食用量。A組平均每只樹鼩食用富士蘋果(39.9±3.1) g/d、溫州柑(9.4±1.6) g/d、大白菜葉(3.9±0.7) g/d、面包蟲干(9.6±1.2) g/d、標準飼料(13.8±1.5) g/d，進食水果總量為(53.2±5.5) g/d。B組平均每只樹鼩食用雪梨(27.7±2.8) g/d、桃(20.5±2.6) g/d、黃瓜(3.6±0.4) g/d、面包蟲干(9.3±1.5) g/d、標準飼料(13.9±1.2) g/d，進食果蔬總量為(51.8±5.1) g/d。所有樹鼩均狀態良好，活動度佳，未見“濕尾”，毛發濃密，較潤澤，無明顯掉毛。

方差分析顯示樹鼩更傾向于選擇蘋果、雪梨、桃等含水量和含糖量較高的新鮮水果，而不傾向于選擇含糖量較低的果蔬。另外，所有樹鼩對面包蟲干接受程度較高(食用量達48%以上)。在第一階段，所有樹鼩的體重均有不同程度的提高(見表1)，兩因素重復測量方差分析顯示，AB兩組樹鼩平均體重的提高程度差異無統計學意義(P=0.098)，而飼養時長對兩組樹鼩平均體重增加有影響，在觀測時間范圍內均增長；不同組別和飼養時長之間存在交互效應。

根據前一階段的結果，在實驗的第二階段給予A、B組富士蘋果、雪梨和桃各100 g，同時給予A組每只20 g/d面包蟲干+50 g/d標準飼料作為輔食，B組每只僅給予70 g/d標準飼料作為輔食。結果顯示，A組平均每只樹鼩食用富士蘋果(27.4±2.2) g/d、雪梨(18.8±1.8) g/d、桃(10.1±0.9) g/d、面包蟲干(12.8±1.1) g/d、標準飼料(15.1±0.7) g/d，進食水果總量為(56.3±3.3) g/d。B組平均每只樹鼩食用富士蘋果(31.0±2.4) g/d、雪梨(23.1±2.4) g/d、桃(11.7±1.4) g/d、標準飼料(14.2±1.5) g/d，進食水果總量為(65.8±5.3) g/d。所有樹鼩均狀態良好，活動度佳，未見“濕尾”，毛發濃密，潤澤，無明顯掉毛。

圖1 第一階段A、B兩組樹鼩每只每日食用新鮮果蔬量Figure 1 The amount of fresh fruit and vegetalde consumed each day by tree shrews in the groups A and B at the first stage

第0天Day 0第3天Day 3第6天Day 6第9天Day 9第12天Day 12第15天Day 15第一階段Stage oneA組Group A102.9±8.7108.5±6.0112.6±7.2117.7±6.8124.3±5.9133.0±7.6B組Group B106.5±7.8109.1±6.4115.2±7.6121.6±8.1124.9±7.5132.3±7.2第二階段Stage twoA組Group A133.1±7.6137.6±7.7142.1±8.5141.5±8.0144.7±6.8146.2±7.7B組Group B132.3±7.2135.8±6.9137.2±7.4136.9±8.3138.3±7.7140.1±8.5

方差分析顯示A、B組間同種水果以及標準飼料的食用量均無統計學差異。同組內不同種水果的食用量，富士蘋果與雪梨間無統計學差異(P=0.095),富士蘋果與桃、雪梨與桃的食用量均有統計學差異(P<0.05)?？梢姡瑯潼毱糜谑秤酶皇刻O果和雪梨。表1顯示了A、B組樹鼩在該階段的平均體重變化，其中投喂面包蟲干的A組比未投喂面包蟲干的B組體重增長趨勢更加明顯，兩因素重復測量方差分析顯示A、B兩組樹鼩平均體重增長有統計學差異(P=0.019)，而飼養時長對兩組樹鼩平均體重增加有影響，在觀測時間范圍內增長；不同組別和飼養時長之間存在交互效應。

由此，我們得出結論：一只健康成年雄性中緬樹鼩滇西亞種的食量約為富士蘋果60 g/d +面包蟲干10 g/d +標準飼料15 g/d。樹鼩在進食過程中有部分食物會從籠底縫隙中掉落而造成損失，在實際飼養過程中可將各類食物加量10% ～ 20%以保證樹鼩的食物攝取量。

2.2 長途運輸應激樹鼩不同營養干預方法對樹鼩存活率的影響

該部分實驗共從中科院昆明動物研究所訂購32只樹鼩，抵達廣西醫科大學實驗動物中心時存活30只。對所有樹鼩進行稱重、狀態描述后進行了隨機分組，每組10只。其中，E組有7只活動度欠佳，4只發生“濕尾”，6只毛發濕潤、無光澤或有掉毛，平均體重(97.3±7.6) g；F組有6只活動度欠佳，6只發生“濕尾”，5只毛發濕潤、無光澤或有掉毛，平均體重(99.7±8.8) g；G組有8只活動度欠佳，6只發生“濕尾”，7只毛發濕潤、無光澤或有掉毛，平均體重(95.2±7.0) g。根據實驗計劃和前一部分的結果，給予E組新鮮富士蘋果100 g/d，給予F組新鮮富士蘋果60 g/d +面包蟲干20 g/d +標準飼料30 g/d，給予G組標準飼料100 g/d。應激期消退后，統計發現E組存活7只，存活率為70%，死亡的3只中有2只是在第1周死亡，1只在第2周死亡；F組存活9只，存活率為90%，1只在第3周死亡；G組存活3只，存活率為30%，第1周死亡5只，第2周和第3周分別死亡1只(如表2)。卡方檢驗和Fisher精確檢驗法顯示E組與F組、E組與G組樹鼩的生存率差異無統計學意義，而F組與G組之間的差異有統計學意義(P=0.020)。

表2 各組長途運輸應激樹鼩死亡數量及存活率

注：G組與F組的存活率相比，*P<0.05。

Note. Comparison of survival rates between groups F and G,*P<0.05.

表3 E、F、G三組樹鼩在第二階段的體重

圖2顯示了各組樹鼩每日平均食量的變化。隨著長途運輸應激的消退和對新環境的逐漸適應，各組進食量均有不同程度的增加。其中，G組日均進食量最少，平均(33.8±3.4) g/只。兩因素重復測量方差分析顯示E組與F組的食量變化無統計學意義(P>0.05)，但E組與G組、F組與G組均有統計學差異(P<0.05)。

表3顯示了E、F、G組樹鼩在應激期的平均體重變化，可見F組上升趨勢最快，E組其次，G組在初期有較大幅度的下降并且始終未能恢復至最初體重。兩因素重復測量方差分析顯示，E、F、G三組均存在統計學差異(P<0.05),說明3種營養干預方法對樹鼩的存活率有影響。在應激期，E、F組極少出現“濕尾”，活動度均可，常在籠具中跳動，毛發干燥、潤澤、無新掉毛現象，且隨著應激的消退和對新環境的逐漸適應而好轉。而G組仍常出現“濕尾”，活動度差，常蜷縮在木盒中。毛發較濕潤、潤澤度差、有掉毛現象，無明顯好轉。

圖2 E、F、G三組的日均食量變化Figure 2 Changes in the daily average food intake of groups E, F and G

2.3 死亡樹鼩的解剖和組織切片HE染色結果

對所有死亡的樹鼩進行解剖后發現，E組有1只出現胃腸道積氣，G組全部出現不同程度胃腸道積氣，主要表現為胃和十二指腸明顯擴張，表面明顯紅腫、充血，內有大量腸液及氣體，空腸和回腸稍有積氣(如圖3)。對死亡樹鼩進行組織切片HE染色后發現，E組有2 只在胃、小腸出現不同程度的炎性細胞浸潤；G組有6只發現胃、小腸、大腸、闌尾等組織均發生不同程度的炎性細胞浸潤(如圖4)。

注：A：正常對照；B、C、D：胃腸道積氣(箭頭所指處)。圖3 樹鼩胃腸道積氣大體解剖圖Note. A, Normal control. B, C, and D, Gas in the gastrointestinal tract (pointed by the arrows).Figure 3 Gross anatomical view of gas accumulation in the gastrointestinal tract of the tree shrews

注：A：胃；B：小腸；C：大腸；D：闌尾。其中，A1、B1、C1、D1為正常對照，A2、B2、C2、D2為炎性細胞浸潤。圖4 樹鼩胃、小腸、大腸、闌尾組織HE染色對比(× 200)Note. A, Stomach. B, Small intestine. C, Colon. D, Appendix. Among them, A1, B1, C1, and D1 are normal controls, and A2, B2, C2, and D2 are inflammatory infiltration.Figure 4 Comparison of HE staining of the stomach, small intestine, large intestine and appendix of the tree shrews

3 討論

3.1 營養干預方法中食物的選擇

在饑餓和疲勞時，新鮮、成熟的水果中低級酯類(乙酸乙酯、甲酸甲酯等)散發出的芳香更能吸引樹鼩的注意力。在實驗觀察中我們發現，當同時投喂切開的不同種類新鮮水果、面包蟲干和顆粒飼料時，樹鼩會優先啃食含糖量較高的新鮮水果，其次選擇捧食面包蟲干。這與其他相關研究結論相一致[17-18]。水果中含有易于吸收的蔗糖、葡萄糖和果糖等[19]，且含水量較高，對于天性喜食甜食，處于長途運輸應激期，尚不適應新的籠具和飼養環境的樹鼩來說，投喂富士蘋果等高含糖量的水果是更好的選擇。同時，從實驗的第一部分可以看出，面包蟲干能為樹鼩提供大量優質動物蛋白，對樹鼩的營養狀況起到了促進作用，而標準顆粒飼料則能夠提供樹鼩所需的其他營養物質和微量元素[17-18, 21]，這些都有助于樹鼩平安消退應激期，降低應激期的死亡率。若僅以顆粒飼料飼養處于應激期的樹鼩，容易造成胃腸道積氣積液、腸梗阻、胃炎、腸炎等消化道疾病。第二部分實驗中E組與G組、F組與G組樹鼩的體重變化和F組與G組的生存率具有統計學意義，說明給運輸應激期樹鼩投喂新鮮水果有助于樹鼩平安度過應激期。然而E組與G組之間生存率無差異，可能是由于樣本數量偏少所致，將在后續研究中增加實驗動物數量以探究投喂優質動物蛋白對運輸應激期樹鼩生存率的影響。實驗中所選擇的食物都是時令性不強、易于獲取、相對經濟的，在實際實驗過程中具有很強的可操作性。

3.2 營養干預的過渡與結束

從圖2可得知，運輸應激樹鼩在第1周的死亡率最高，第2周逐漸下降，第3周時趨于平穩，推測樹鼩綜合應激期的消退約在2周內。由此可見樹鼩在抵達實驗環境后2周內體內內環境波動較大，建議至少穩定2周后再進行實驗干預，以保證實驗結果的可靠性。樹鼩應激期消退后，消化道PH值逐漸恢復正常水平[22-24]，可以耐受標準顆粒飼料中的蛋白質，所以營養干預應施加不低于2周，自第3周起可逐漸減少新鮮水果和面包蟲干的量，增加標準顆粒飼料，直至恢復為由標準顆粒飼料進行飼養。在進行對血糖控制要求不高的實驗時，可以考慮給樹鼩間斷添加新鮮水果作為輔食，以加強樹鼩對不利環境因素的抵抗性。

3.3 其他應當注意的管理方法

樹鼩不群居，領地意識極強，會在自己的領地上留下氣味[25]。雄性兇暴好斗，對同類的氣味較敏感[14]，陌生的氣味會讓樹鼩感到緊張。故應注意保持樹鼩的左右鄰居關系；在更換籠具、水瓶、食盒等用具時，應盡量注意對應關系，或先將用具洗凈晾干后再給樹鼩使用。

樹鼩生性膽小易驚，且行動敏捷，在抓取樹鼩時容易使之受到驚嚇，甚至在逃跑過程中撞擊籠壁而受傷。經常性抓取和長時間剝奪身體自由中會導致動物發生獲得性無助抑郁和束縛應激抑郁[26-27]，嚴重威脅樹鼩的生理代謝和心理健康。故抓取樹鼩不應過于頻繁，抓取時動作應盡量輕柔，固定于保定袋內的時間不宜過長，完成測量后應盡快將樹鼩放回籠具中。

運輸綜合應激反應不僅威脅實驗動物的生理和心理健康，而且干擾實驗結果的準確性，對于生性膽小的樹鼩，甚至會導致死亡；通過營養干預有助于樹鼩渡過應激期，減少長途運輸應激期中樹鼩的死亡率，有利于樹鼩精神狀態的恢復。目前有關樹鼩的應用研究要遠多于樹鼩的基礎研究，這不利于樹鼩研究的長久發展，未來期待能更多的關注到樹鼩的基礎研究，盡早實現樹鼩的實驗化、標準化和規?；猿浞职l揮樹鼩作為人類疾病動物模型的優勢。