生物發光人肝癌裸小鼠原位癌模型的構建

趙 源，張超超，路 璐，吳文斌，朱賢丹，樊海艇，丁 越*

(1.上海中醫藥大學實驗動物中心，上海 201315； 2.上海中醫藥大學教學實驗中心，上海 201315)

原發性肝癌(primary liver cancer，PLC)是全球惡性程度最高的消化系統癌癥之一[1-2]，并且臨床上手術切除等傳統治療效果差，術后轉移及復發率高[3-4]。國內外研究人員做了許多關于癌癥轉移及復發的基礎性工作，獲得了顯著的成果，但現在急需一些符合臨床研究需求的合格動物肝癌模型，用于抗腫瘤新藥的篩選。

常用于癌癥研究的實驗動物是裸小鼠，因其天然缺乏免疫力，而且該品系動物形態較小，易于飼養及運用小動物成像儀評價。HCCLM3細胞株是中山醫院肝病所運用重復多次肺轉移篩選法，從人肝癌MHCC97H細胞株裸小鼠皮下接種模型的肺轉移灶挑選所得[5]。肝癌的高死亡率及療效差的根本原因是肝癌患者五年內易發生轉移與復發，基于以上考慮，我們構建一個可定量分析腫瘤轉歸過程的癌癥動物模型，利用該模型篩選具有抗癌活性的中藥新藥及評價適合的肝癌治療手段[6-7]。

熒光素酶基因是一種ATP酶的報告基因，其成像原理為熒光素酶(luciferase，Luc)、ATP、熒光底物(D-luciferin)、Mg2+與O2為底物，在Mg2+催化條件下，轉化化學能為光能，并激發的光譜位于560 nm之間的可見光，對機體正常細胞無電離輻射作用，正常組織器官的機能不受影響[8-10]。利用活體成像設備可以定量分析標記細胞在機體體表的表達區域以及產生光子數量。生物發光人肝癌裸小鼠原位癌模型是可用于模擬人類肝癌的生長增殖情況，而且利用小動物活體成像儀可客觀地、有效地定量分析動物模型，該模型可用于癌癥治療手段評估、抗癌癥復發與轉移效果及篩選抗癌中藥新藥等領域。將在本文中著重研究HCCLM3-Luc肝癌裸小鼠原位癌模型的構建與評價。

1 材料和方法

1.1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級BALB/c-nu裸小鼠20只，6周齡左右，雄性，體重18～20 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[SCXK (滬) 2013-0016]，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心的SPF級屏障系統[SYXK (滬) 2014-0008]IVC籠架內，自由攝取飼料、飲水，飼料由60Co輻射滅菌，墊料、飲水、籠具等均經蒸汽高壓滅菌，環境溫度控制在18℃ ～ 25℃，相對濕度40% ～ 70%。動物購入經適應性飼養5 d后開展動物實驗，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。實驗方案和動物操作均經上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準，批準編號：SZY 201803004。

1.1.2 細胞系

穩定表達熒光素酶Luc的人高轉移肝癌細胞系(HCCLM3-Luc)保存于上海中醫藥大學教學實驗中心附屬實驗室內液氮罐中。

1.2 主要試劑與儀器

D-熒光素鉀鹽(英國，Perkin Elmer公司，批號K9909PE)；胎牛血清(以色列，BioInd公司，批號：1608795)；DMEM培養液(美國，HyClone公司，批號：AE26543270)；紅霉素眼藥膏(中國，馬應龍藥業集團股份有限公司，批號：180202)。快速滅菌器(中國，上海曉航貿易有限公司，型號FST350)；小鼠獨立通風系統(意大利，泰尼百斯有限公司，型號S.P.A)；小動物麻醉機(中國，上海乾福生物科技有限公司，型號MSS-3)；高壓滅菌器(日本，三洋機電株式會社，型號HVE 50)；冷光源燈(中國，瑞沃德生命科技公司，型號F-150C)；活體動物可見光成像系統(美國，珀金埃爾默股份有限公司，型號Lumina Ⅱ Living Image 4.3型)；CO2培養箱(德國，Binder有限公司，型號：binder cell 150型)；倒置熒光顯微鏡及熒光成像系統(中國，麥克奧迪(廈門)實業集團，型號：BA400EF-UPR)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞復蘇

將存有HCCLM3-Luc的凍存管從液氮罐中取出，迅速放入37℃恒溫水浴鍋中快速解凍，其間用鑷子夾住細胞凍存管在溫水中輕輕晃動，使凍存管內細胞可均勻受熱快速融解。用微量移液槍充分混勻解凍的HCCLM3-Luc細胞液，然后抽取1 mL細胞液加入預存有10 mL室溫PBS的離心管，再用移液管反復吹打、混勻若干次。用低溫離心機以800 r/min離心5 min，棄上清液，再加入10 mL室溫PBS，重復三次。用移液槍輕輕懸浮細胞，并加入完全培養液，計數細胞。接種細胞到50 mL的培養瓶中，起始密度為每毫升2×105個細胞。

1.3.2 細胞培養

將復蘇的細胞懸液接種至含10%胎牛血清的DMEM細胞培養瓶中，定容至10 mL，800 r/min低速離心5 min，棄上清液，加新鮮的高糖DMEM培養液，輕輕吹打多次，重懸細胞液，轉移至培養瓶，置于37℃、5% CO2培養箱中增殖培育。每天在倒置顯微鏡下觀察HCCLM3-Luc細胞的形態和生長情況，并根據細胞生長狀態進行換液、轉瓶擴增。

1.3.3 細胞收集

收集進入對數生長期的HCCLM3-Luc細胞，將生長狀態好的細胞懸液用PBS溶液漂洗3次，在倒置顯微鏡下使用血細胞計數板，調定細胞數量，將PBS重懸的細胞懸液暫存于盛有碎冰盒內，爭取30 min內完成皮下注射及尾靜脈注射細胞懸液的實驗。

1.3.4 活體成像儀檢測細胞熒光素酶表達情況

將傳代培養后進入對數生長期的HCCLM3-Luc細胞按不同細胞數量(1×105、5×104、2.5×104、1.25×104、5×103、2.5×103)分別置于無菌96孔細胞板中，利用小動物活體成像儀測定不同細胞數量HCCLM3-Luc細胞的熒光素酶生物發光表達情況，探索細胞數量與熒光素酶生物發光值的線性關系。

1.3.5 HCCLM3-Luc尾靜脈注射構建肝癌原位癌動物模型

選用6只裸小鼠，先用醫用消毒片輕輕從裸小鼠尾尖部開始擦拭2 min，擴張尾部血管，助手輕輕壓迫裸小鼠尾部雙側靜脈，操作人員用1 mL胰島素注射器抽取已重懸HCCLM3-Luc細胞懸浮液，距約尾尖1/3處進針，根據預實驗報道確定注射細胞接種量，以每只0.2 mL將2.5×107個細胞/mL經尾靜脈注入裸小鼠體內。25～35 s內完畢注射以防止動物發生肺部栓塞死亡。

造模成功后，觀察動物的一般生長情況，且記錄模型的成瘤時間、成瘤時間、成瘤率、生存期等腫瘤一般生長情況，同時利用小動物成像儀，定期定量分析模型的體表區域的熒光表達情況以及發光強度。

1.3.6 原位癌模型的建立方法

將HCCLM3-Luc皮下瘤瘤源供體動物(頸椎脫臼法)安樂死后，切取供體瘤源。瘤塊取下后置于4℃生理鹽水中輕柔地沖洗三遍去除血漬，同時用眼科剪刀和眼科鑷修飾瘤塊，將非活體腫瘤組織(外周的皮膚、肌肉、凋亡細胞或結締組織等)去除，挑選如新鮮魚肉樣、色澤明亮呈半透明樣的活性良好瘤塊作為移植手術瘤源，將其切成大小1 mm3的瘤塊小塊備用，受體動物用小動物呼吸麻醉機麻醉固定于手術操作臺上，使用碘伏和70%乙醇對上腹部手術區域皮膚進行消毒處理后，在上腹部偏左肝的部位切開長度約l cm的斜切口，將肝左側葉用無菌棉簽拖出腹腔暴露。使用顯微剪在肝左葉上做一個十字切開小切口，將供體的瘤塊用5-0縫合線縫合在肝上，迅速完成十字交叉縫合。用無菌棉棒將肝輕柔推回腹中，使用4-0帶針縫合線逐層縫合肌層和外皮，最后用紅霉素眼藥膏對創口進行消炎處理，手術好的裸小鼠放于恒溫加熱墊上保溫，待其完全蘇醒后放回IVC籠盒內。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 HCCLM3-Luc細胞熒光酶表達情況測定性測定

將含有處于對數生長期的HCCLM3-Luc細胞的黑色96孔板，置于Lumina Ⅱ活體成像暗室內定量分析；在96孔細胞板中，檢測到含不同細胞數量HCCLM3-Luc的細胞孔均發出熒光表達不同強度的光點，說明HCCLM3細胞利用病毒轉染熒光素酶基因后細胞活力良好，基本保持了HCCLM3細胞株的生長情況，并且體外增殖培養后，熒光表達強度穩定，與細胞數量成正比例關系。

用高糖DMEM培養基將HCCLM3-Luc細胞在黑色的96孔板中進行倍比稀釋，細胞數從2500個/孔至100 000個/孔，活體成像前15 min加入15 mg/kg熒光素底物，然后使用Living Image 4.2軟件檢測各孔的熒光值，并進行數據收集和定量分析。

通過繪制標記熒光素酶報告基因的腫瘤細胞數與生物發光光子量曲線圖(圖1A)，可得知發光強度與HCCLM3-Luc細胞數量有較好的線性關系(R2=0.9989，直線方程式為Y=1155.8X+ 1×106)，說明我們可以通過定量分析腫瘤細胞的光子量來推到出活體腫瘤的數量。

此實驗最小檢測的細胞數量約為2500個/孔，平均ROI值約為每個細胞140光子/s，表明Luc熒光基因已穩定轉染入HCCLM3細胞株，說明了研究者定量分析體表的熒光值可以客觀全面地反映機體內活體腫瘤細胞的生長情況(圖1B)。

注：A：HCCLM3-luc細胞數與生物發光光子量曲線圖；B：HCCLM3-luc細胞體外生物發光成像。由圖可見，細胞數量與生物發光強度有線性關系。圖1 HCCLM3-luc生物發光成像Note. A, Curve of linear correlation between the HCCLM3-luc cell numbers and the fluorescence intensity of bioluminescence photons. B, Bioluminescence imaging of the HCCLM3-Luc cells in vitro. As shown in the figure, the bioluminescence intensity of cells was positively correlated with the number of cells.Figure 1 Bioluminescence imaging of the HCCLM3-Luc cells

2.2 動態監測接種1 mm3瘤塊原位癌模型的一般生長情況

接種1 mm3瘤塊經原位接種途徑造模，發現BALB/c-nu裸小鼠在第3天生物發光成像中，可觀察到裸小鼠腹部肝區域出現一塊明顯的生物成像光斑點，接種后7 d觀察裸小鼠腹部肝區域強發光點逐漸增強，并且向腹腔轉移趨勢，同時我們發現裸鼠的生物發光強度逐漸增強，并且在接種后21 d裸小鼠全腹腔皆出現全身廣泛的生物發光成像發光點，表示BALB/c-nu裸小鼠的原位移植癌模型通過接種瘤塊方式可模擬人類肝癌疾病模型的多種癥狀。如圖2所示。

注：A：HCCLM3-Luc細胞的肝原位癌接種腫瘤生長曲線；接種后18 d，腫瘤組織的熒光值加速升高；B：BALB/c-nu裸鼠原位移植肝癌后腫瘤生長情況的活體成像圖；在接種后18 d，裸鼠的腫瘤組織熒光值加速升高，并出現多處轉移灶。圖2 BALB/c-nu裸小鼠原位癌模型的生長情況Note. A, Orthotopic inoculation tumor growth curve of HCCLM3-Luc cells. The bioluminescence intensity of the tumor tissues was significantly increased 18 days after inoculation. B, Bioluminescence imaging of orthotopic inoculation tumor growth. The bioluminescence intensity of tumor tissues of the nude mice was significantly increased and multiple metastases were found in the nude mice in different regions 18 days after inoculation.Figure 2 Growth conditions of the BALB/c-nu nude mouse model of orthotopic inoculation tumor

2.3 尾靜脈注射HCCLM3-Luc肝癌原位模型的構建

尾靜脈途徑造模組的BALB/C-nu裸小鼠在第3天生物發光成像中，可觀察到裸小鼠體表區域有強烈的熒光表達情況，主要集中在兩肺區域，并且兩肺有兩塊強烈的發光的點，右肺光子量表達明顯地強于左肺，這現象符合腫瘤細胞血行播散的特點，因為腫瘤細胞經尾靜脈注射進入動物體內后，經右心房、右心室、抵達肺的微小血管組織內著床，因此，模型動物早期體表兩肺區域有強的生物發光表達。

接種后7 d觀察到裸小鼠肺部強發光點逐漸減弱，并且有向腋窩，腹股溝部分轉移趨勢，接種后15 d僅出現腹部有明顯的生物成像發光點，最后接種后21 d裸小鼠皆出現全身廣泛的生物發光成像發光點，表示HCCLM3-Luc細胞株可能已經全身通過血行，擴散至動物全身，可能出現肝、脾等器官轉移(圖3)。

結果顯示：通過尾靜脈注射腫瘤細胞造模方式的肝癌原位模型成瘤率為(35.24 ± 11.36)%(根據體表區域熒光表達達到1×105為標準)。造模第25天，全部6只模型動物安樂死后，解剖取材時在裸鼠肝組織肉眼尚未可見有明顯的肝癌癌巢等肝病變表現，可見采用尾靜脈注射構建肝癌原位癌模型時腫瘤細胞容易發生轉移，不只是生成肝原位癌。

注：接種后約21 d，尾靜脈途徑造模組呈現全身轉移病灶。圖3 BALB/c-nu裸小鼠尾靜脈接種HCCLM3-Luc克隆細胞后腫瘤生長情況的活體成像Note. Multiple metastases were found in the nude mice in different regions 21 days after injection with HCCLM3-Luc cell suspension through the tail vein.Figure 3 In vivo imaging of the tumor growth of HCCLM3-Luc clone cells intravenously injected into the BALB/c-nu nude mice through the tail vein

3 討論

近十年來，分子影像成像技術被廣泛運用于腫瘤動物模型研究。人們運用分子影像技術可以直觀地、無創性檢測動物體內腫瘤轉歸過程，并且為尋找有效的抗腫瘤新靶點提供新的實驗技術方法。

隨著高新科技的不斷出現，科研人員設想得到一種安全可靠的檢驗手段，以期可早期診斷體內腫瘤。光學成像具有眾多優點[11]：靈敏度高、實時、非侵入、安全性好以及成像系統費用相對較低，使得光學成像尤為適合小動物腫瘤研究。一般常用的小動物活體成像儀集合了X光檢測(X-ray inspection)、活體動物熒光成像(fluorescence imaging，FLI)和生物發光成像(bioluminescence imaging，BLI)三大功能模塊。熒光技術采用熒光報告基團標記腫瘤細胞或細菌等研究對象，而生物發光成像是用熒光素酶報告基因對其進行轉染[12]。利用精度靈敏的發光檢測儀，可以在活體內直接動態監測細胞活動。同其他類型成像技術比較，生物發光成像以其高靈敏性、時效性高、實驗數據直觀、非放射性及費用低廉等優點，在短短的幾年時間內，迅速地成為生命科學及醫學等研究領域的熱點技術[13]。

在本研究中，我們將熒光素酶基因轉染人肝癌細胞株HCCLM3，讓其在體外可穩定表達熒光值，同時評價其發光能力。分別采用尾靜脈注射細胞懸液和原位癌接種瘤塊的方式，構建人肝癌裸小鼠原位癌動物模型，結合生物發光技術，在整體水平上運用Lumina Ⅱ型活體動物可見光成像系統對腫瘤組織的生長進行實時監測，成功地構建了穩定表達熒光素酶報告基因的人肝癌荷瘤裸小鼠模型，可為示蹤腫瘤生長和評價中藥抗癌活性化合物的治療效果提供研究基礎。

在成功構建的人肝癌裸小鼠原位癌動物模型中，利用Lumina Ⅱ型小動物活體成像儀檢測，可觀察到腫瘤的實時動態熒光表達情況。而在傳統的荷瘤裸鼠模型中，皮下瘤通常采用測量瘤徑大小的方法檢查腫瘤的生長情況，然而這種檢測方式在造模初期，無法觀測腫瘤的生長情況。而對于普通的肝癌原位癌模型，需要借鑒超聲波技術檢測體內腫瘤大小，這個增加了實驗操作的難度。而本實驗構建的HCCLM3-Luc肝癌腫瘤模型在造模后第3天，就能測量到腫瘤細胞生物發光表達，且我們定量分析到腫瘤的熒光素酶表達強度，隨著造模的時間增長而不斷增強。因此利用生物發光成像技術追蹤腫瘤細胞的增殖、轉移等生長情況，不僅可以觀察到體外已經成瘤的瘤塊，而且觀察到模型造模早期存有少量腫瘤細胞的熒光表達情況，在腫瘤模型上具有一定的先進性。

綜上，本章初步建立了穩定表達熒光酶基因的人肝癌裸小鼠原位癌模型，通過優化原位癌模型的種植部位和體積數量，并且優選了人肝癌裸小鼠原位癌的構建方法，采用肝葉移植腫瘤組織，通過條件優化，目前成功率高達(75.2 ± 7.2)%。該動物模型具備高成瘤率、操作方法重復性高、手術技術要求低、造模時間短，可客觀真實地監測腫瘤組織生長等優點，該動物模型可用于中藥抗腫瘤活性成分的篩選。