BTG1過表達對胰腺癌細胞增殖、侵襲和cyclin D1、cyclin B1、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

王開瓊，邢貽雷，喬 欣，李仕總，宮東偉，余智威，吳奕強

(海南省人民醫院膽胰外科，海口 570311)

胰腺癌是一種常見的消化系統惡性腫瘤，具有惡性程度高、早期診斷困難、病情進展快和預后效果差等特點，胰腺導管腺癌是其重要的病理類型，約占全部胰腺癌的90%以上[1]。在我國，胰腺癌發病率位居惡性腫瘤的第8位，五年生存率只有7.2%[2]。目前，能夠進行手術根除性治療的患者只有不到20%，大部分患者就診時已發生局部轉移[3]。因此，闡明胰腺癌發生發展的分子機制以及尋找有效的治療靶點一直是學術界研究的熱點。B細胞易位基因1(BTG1)是TOB/BTG家族成員，被報道在喉鱗狀細胞癌、胃癌和結腸癌等多種腫瘤組織或細胞中異常低表達，具有調控細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等多種生物學功能，有望成為腫瘤診斷和治療的潛在靶點[4-6]。近年來，有報道發現BTG1在胰腺導管腺癌組織中表達下調，且與腫瘤的分期、淋巴結轉移和預后不良等密切相關[7]，但BTG1在胰腺癌發生發展中的作用及其機制尚不清楚。因此，本研究通過體外細胞實驗構建BTG1過表達的胰腺癌細胞株，探討BTG1對胰腺癌細胞增殖和侵襲的影響，并探討其可能的分子機制，以期為胰腺癌的診治提供新的靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人胰腺癌細胞株PANC-1、AsPC-1、BxPc-3和人正常胰腺導管上皮細胞株H6C7，來源自美國ATCC。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養基、青/鏈霉素和胎牛血清，美國Gibco公司(批號分別為8115051、15140-122、SH41289)；Lipofectamine 2000、Opti-MEM培養基和TRIzol試劑，美國Invitrogen公司(批號分別為11668027、31985-070、15596-026)；二甲基亞砜，上海國藥集團化學試劑公司(批號20160915)；碘化丙錠、噻唑藍(MTT)試劑，美國Sigma公司(批號分別為MKBP1360 V、M2128)；Matrigel基質膠，美國BD Biosciences公司(批號為356234)；細胞IP裂解液、SDS-PAGE上樣緩沖液和ECL發光試劑盒，上海碧云天生物公司(批號分別為C1054、P0015、P0018)；鼠抗人BTG1、細胞周期蛋白D1(cyclin D1)、細胞周期蛋白B1(cyclin B1)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)和基質金屬蛋白酶9(MMP-9)和β肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體，美國Santa Cruz公司(批號分別為、SC-450、SC-70898、SC-10736、SC-21733、SC-47778)；辣根過氧化酶標記的山羊抗鼠二抗，北京中杉金橋生物公司(批號為107724)；pcDNA3.1-BTG1過表達質粒和pcDNA3.空載體質粒由海南大學生物技術實驗中心提供；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒，上海捷瑞生物公司(批號為1008G18)；逆轉錄試劑盒，北京智杰方遠科技有限公司(批號為K1622)；PCR反應試劑盒，北京百奧萊博科技有限公司(批號為RFT100)。Transwell小室(美國Corning公司)；Eco-170 CO2培養箱(美國Harris公司)；BDS200倒置顯微鏡(重慶奧特光學儀器公司)；550型全自動酶標儀、GelDoc EZ型凝膠成像分析系統和CFX96實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；C6流式細胞儀(北京科譽興業科技公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

采用含有胎牛血清100 g/L和青鏈霉雙抗各100 U/mL的DMEM培養基于CO2體積分數為5%的37℃恒溫培養箱中培養PANC-1、AsPC-1、BxPc-3和H6C7細胞株。每2 ～ 3 d換液一次，當細胞鋪滿瓶底80%左右時，加入0.25%胰蛋白酶消化，并按照1∶3的比例進行傳代。

1.3.2 qRT-PCR檢測BTG1 mRNA的表達

參照TRIzol試劑說明書提取總RNA，并將其反轉錄合成單鏈cDNA。以cDNA為模板，進行PCR擴增。分析產物熔解曲線檢測目的基因的特異性，目的基因的相對定量分析采用β-actin內參基因循環閾值進行標準化，數據采用2-△△Ct法進行分析。PCR反應條件：94℃滅活或預變性5 min；94℃變性30 s、60退火30 s、72℃延伸30 s，循環40次，72℃延伸5 min。由美國Invitrogen公司合成的PCR引物序列如下：BTG1-F：5’-CACCATGCATCCCTTCT ACACCCGG-3’，BTG1-R：5’-TTAACCTGATACAG TCATCATATTG-3’；β-actin-F：5’-CCAAGGCCAACC GCGAGAAGATGAC-3’；β-actin-F：5’-AGGTACATG TGTGCCGCCAGAC-3’。實驗重復3次。

1.3.3 Western blot檢測BTG1、cyclin D1、cyclin B1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達

采用IP細胞裂解液提取待測細胞的總蛋白后，并以BCA法測定總蛋白的濃度。總蛋白60 μg/孔在SDS-PAGE凝膠中電泳分離后，轉膜。將PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的Tween 20溶液中常溫下搖床孵育1 h。4℃下，轉入含特異性一抗的Tween 20溶液中搖床孵育24 h。采用Tween 20溶液浸洗10 min × 3次后，37℃下轉入含二抗的Tween 20溶液中搖床孵育1 h。再經Tween 20溶液洗膜3次后，加入ECL發光劑暗室內顯影曝光。以β-actin為內參，分析目的蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

1.3.4 細胞分組及轉染

實驗分為對照組(未轉染)、pcDNA3.1組(轉染pcDNA3.空載體質粒)和BTG1組(轉染pcDNA3.1-BTG1過表達質粒)，每組設3個復孔。取第5代生長良好的對數生長期BxPc-3細胞以2.5×105個/孔平鋪于6孔細胞板上，于細胞培養箱中常規培養至70%融合度時，參照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書步驟根據實驗分組將pcDNA3.空載體質粒和pcDNA3.1-BTG1過表達質粒轉染至BxPc-3細胞中。轉染24 h后，采用qRT-PCR和Western blot檢測轉染效果。

1.3.5 MTT法檢測BxPc-3細胞增殖能力

采用0.25%胰蛋白酶消化對照組、pcDNA3.1組和BTG1組細胞，以每孔100 μL細胞懸液(濃度為1×104個/mL)接種于96孔板上，每組設置3個復孔。置于培養箱內分別培養48, 72, 96 h后，加入5 mg/mL MTT試劑20 μL /孔。孵育4 h后，棄上清，加入150 μL二甲基亞楓震蕩反應15 min。酶聯免疫檢測儀測定492 nm波長處各組BxPc-3細胞的吸光度(OD)值。實驗重復3次。

1.3.6 流式細胞術檢測BxPc-3細胞的周期分布

將對數生長期的對照組、pcDNA3.1組和BTG1組(每組3個重復)細胞以0.25%胰蛋白酶消化后，1000 r/min離心5 min棄上清液。經預冷的PBS漂洗2 ～ 3次后，于4℃下加入2 mL預冷的70%乙醇固定24 h。離心棄乙醇后，以PBS漂洗細胞。棄上清后，加入含RNA酶的碘化丙啶溶液避光染色20 min。采用流式細胞儀檢測各組BxPc-3細胞的周期變化。實驗重復3次。

1.3.7 Transwell小室檢測BxPc-3細胞侵襲能力

取Transwel小室放入24孔細胞板中，將Matrigel基質膠以100 μL/孔鋪于小室底部的聚碳酸酯微孔膜上。置于4℃下充分聚合成膠。以胰蛋白酶消化待檢細胞后，制備濃度為 5×104/mL的細胞懸液。按照每孔200 μL細胞懸液接種至成膠的Transwel小室上層，并于下層中加入600 μL/孔含胎牛血清的細胞培養液。細胞培養箱中常規培養48 h后，以棉簽小心擦去未穿膜的細胞。常溫下，先以甲醛固定30 min，再以0.5%結晶紫染色15 min。顯微鏡下觀察，結果以隨機選取的5個視野細胞數的平均值表示。實驗重復3次。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 BTG1在胰腺癌細胞中低表達

qRT-PCR檢測發現，與正常胰腺導管上皮細胞H6C7相比，胰腺癌細胞PANC-1、AsPC-1和BxPc-3中BTG1 mRNA的表達水平逐漸降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)。Western blot檢測與qRT-PCR檢測結果相一致，與H6C7細胞相比，BTG1蛋白在PANC-1、AsPC-1和BxPc-3細胞中的表達水平均明顯降低(P<0.05)，且BxPc-3細胞差異最為顯著。故后續選用胰腺癌BxPc-3細胞進行實驗。結果見圖1和表1。

圖1 胰腺癌細胞中BTG1蛋白的表達Figure 1 BTG1 protein expression in the pancreatic cancer cells

細胞系Cell lineBTG1蛋白BTG1 proteinBTG1 mRNAH6C70.67±0.041.00±0.05PANC-10.35±0.03?0.82±0.04?AsPC-10.23±0.03?0.67±0.03?BxPc-30.11±0.02?0.54±0.03?F值F-value183.15879.780

注：與H6C7細胞系比較，*P<0.05。

Note. Compared with the H6C7 cell line,*P<0.05.

表2 轉染效果及上調BTG1表達對細胞增殖的影響

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05.

2.2 上調BTG1表達抑制胰腺癌BxPc-3細胞增殖

qRT-PCR和Western blot檢測發現，轉染pcDNA3.1-BTG1過表達質粒的BTG1組細胞中BTG1 mRNA和蛋白的表達水平較對照組明顯升高(P<0.05)；而轉染pcDNA3.1空載體的pcDNA3.1組與對照組間差異無統計學意義(P>0.05)。MTT實驗檢測發現，與對照組相比，BTG1組細胞在48, 72, 96 h時間點的OD值均明顯降低，細胞增殖能力減弱(P<0.05)；而pcDNA3.1組與對照組細胞的增殖能力差異無統計學意義(P>0.05)。結果見圖2和表2。

圖2 各組中BTG1蛋白的表達Figure 2 BTG1 protein expression in each group

2.3 上調BTG1表達誘導胰腺癌BxPc-3細胞周期阻滯于G0/G1期

流式細胞儀檢測發現，pcDNA3.1組細胞在G0/G1期、S期和G2/M期所占的百分比與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)；但BTG1組細胞在G0/G1期的百分比明顯高于對照組，在S期的百分比明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。Western blot進一步檢測周期相關蛋白cyclin D1和cyclin B1的表達發現，與對照組相比，BTG1組細胞中cyclin D1和cyclin B1蛋白的表達水平均明顯降低(P<0.05)；而pcDNA3.1組與對照組相比，cyclin D1和cyclin B1蛋白的表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。結果見圖3和表3。

圖3 各組中cyclin D1和cyclin B1蛋白的表達Figure 3 Cyclin D1 and cyclin B1 protein expression in each group

表3 上調BTG1表達對胰腺癌細胞周期的影響

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05.

表4 上調BTG1表達對胰腺癌細胞侵襲的影響

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05.

2.4 上調BTG1表達抑制胰腺癌細胞侵襲

與對照組相比，pcDNA3.1組的穿膜細胞數和MMP-2、MMP-9蛋白的表達水平無明顯改變(P>0.05)，而BTG1組的穿膜細胞數以及MMP-2、MMP-9蛋白的表達水平均明顯低于對照組(P<0.05)。結果見圖4和表4。

圖4 各組中MMP-2和MMP-9蛋白的表達Figure 4 MMP-2 and MMP-9 protein expression in each group

3 討論

BTG1最早是從慢性B淋巴細胞性白血病染色體上得到的，后又從淋巴母細胞中分離出來，定位于12q22染色體上，可通過調控細胞周期進程調節細胞的增殖過程，在腫瘤的發生發展過程中扮演著重要角色[8]。BTG1在食管癌組織中表達降低，與腫瘤的淋巴結轉移、臨床分期、組織學分級和總體生存時間顯著相關，上調其表達后，可通過抑制cyclin D1、Bcl-2和MMP-9蛋白的表達減弱Eca-109細胞的增殖、侵襲、遷移能力，增強細胞凋亡能力，升高G0/G1期細胞比例[9]。BTG1在胃癌組織中的表達明顯低于非腫瘤性粘膜和淋巴結轉移癌，與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期和預后效果差等呈正相關，BTG1過表達能夠明顯抑制BGC-823和MKN28細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞周期G2/M期阻滯、細胞分化、衰老和凋亡[10]。在結直腸癌中，BTG1過表達可誘導HCT-15細胞阻滯于G2期，也可誘導HCT-116細胞阻滯于G1期，同時也可增強腫瘤細胞對紫杉醇和順鉑等化療藥物的敏感性[6]。可見，BTG1在腫瘤發生發展過程中發揮著類似抑癌基因的作用，并可能是腫瘤潛在的生物標志物和治療靶點。有報道發現，BTG1在胰腺癌組織中異常低表達，與臨床分期、淋巴結轉移和預后不良等有關[7,11]，但目前BTG1在胰腺癌發生發展中的作用并不明確。本研究通過體外細胞實驗，初步驗證了BTG1在人胰腺癌細胞株PANC-1、AsPC-1、BxPc-3中低表達。通過轉染pcDNA3.1-BTG1過表達質粒成功構建BTG1過表達的BxPc-3細胞株后，檢測發現BxPc-3細胞的增殖和侵襲能力明顯減弱；同時發現，BxPc-3細胞在G0/G1期的百分比明顯升高，S期的百分比明顯降低，細胞被阻滯于G0/G1期。該結果與BTG1在既往研究中發揮的抑癌基因的結果相一致。

細胞周期失控導致的腫瘤細胞惡性增殖是腫瘤發生發展的重要原因，該過程受到細胞周期依賴性蛋白激酶和細胞周期蛋白等多種因子的共同調控；cyclin D1和cyclin B1是調節細胞周期活性的兩種重要的周期蛋白，前者是調控G1/S期轉變的G1期細胞周期蛋白，后者是促進G2/M期轉換的分裂期周期蛋白，兩者均在胰腺癌組織或細胞中異常表達，參與細胞的周期調控，進而推動腫瘤細胞的惡性增殖[12-13]。進一步檢測cyclin D1和cyclin B1蛋白的表達發現，BTG1過表達可下調BxPc-3細胞中cyclin D1和cyclin B1蛋白的表達。這一結果與Zhu等[14]研究得到的BTG1過度表達可通過抑制cyclin D1和cyclin B1表達誘導細胞阻滯于G0/G1期，抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞增殖的分子機制相吻合。這也提示，BTG1過表達可能通過抑制cyclin D1和cyclin B1表達誘導胰腺癌細胞周期阻滯于G0/G1期，進而抑制癌細胞增殖。胰腺癌的發生發展不僅與腫瘤細胞的惡性增殖有關，細胞的侵襲也是影響其進展的重要因素。基質金屬蛋白酶家族是一類與細胞侵襲和轉移關系密切的鋅依賴性內肽酶家族，MMP-2和MMP-9是該家族中重要的明膠酶，在胰腺癌細胞侵襲和轉移過程中發揮著重要作用[15-16]。為了進一步探討BTG1調控胰腺癌細胞侵襲的分子機制，本研究進一步檢測發現，在BTG1過表達的BxPc-3細胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達明顯受到抑制。提示，BTG1過表達可能通過下調MMP-2和MMP-9表達抑制胰腺癌細胞的侵襲。

綜上所述，BTG1在胰腺癌細胞中低表達，在胰腺癌的發生發展過程中可能起著負調控作用。上調BTG1表達可通過抑制胰腺癌細胞增殖和侵襲，其作用機制可能與下調cyclin D1、cyclin B1、MMP-2和MMP-9表達有關。BTG1具有多種生物學功能，本研究僅涉及到了胰腺癌細胞增殖、細胞周期和細胞侵襲部分生物學作用，后期將會從胰腺癌細胞凋亡及放化療方面入手探討BTG1在胰腺癌中的作用，為以BTG1為靶點的胰腺癌基因治療提供實驗依據。