基于α-突觸核蛋白原纖維的帕金森氏疾病模型的研究進展

羅海玉，吳正存，馬開利

(1.中國醫學科學院&北京協和醫學院，醫學生物學研究所，藥物安全性評價研究中心，昆明 650118；2.中國醫學科學院&北京協和醫學院，醫學靈長類研究中心&神經科學中心，北京 100005)

帕金森氏病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的神經系統退行性疾病，發病率僅次于阿爾茲海默癥[1]，其主要的臨床癥狀表現為運動功能障礙和靜止性震顫，并且常伴隨有抑郁和睡眠障礙等非運動癥狀[2]。一旦發病，將對患者的身心造成嚴重損害，同時，給整個家庭帶來巨大的經濟和精神負擔。PD的主要病理學表現為中腦多巴胺能神經元死亡和紋狀體損失，主要的病理學標志為中腦黑質致密部形成的路易小體(Lewy bodies，LBs)[1, 3]。LBs是黑質致密部可見部分的一種球狀包涵體，主要成分為部分中空的放射狀淀粉樣纖維，而該淀粉樣纖維的主要成分為α-突觸核蛋白(α-synuclein，AS)[3]。

1988年，Maroteaux等人[4]在電鱘體內首次發現了AS的存在，并且確定了其位于突觸前末梢和核周。隨后，AS被證實是LBs的主要成分并且與PD的發生有密切的關系，并且越來越多的研究將AS作為了PD致病機制研究中的關鍵蛋白。近年來，有大量研究表明，異常聚集的AS具有類朊病毒樣的傳播特性，其能夠在神經元細胞之間進行傳播，導致腦內更多AS聚集體的產生，最終造成大腦中負責運動區域的神經元死亡[5-6]。于是，研究者們將AS原纖維接種于原代神經元細胞，發現誘導產生了大量包涵體并且發現其磷酸化水平明顯升高[7]。同時，利用AS原纖維建立的PD動物模型能誘導產生大量類LBs的包涵體，與PD病人的病理特征相類似[8]。更重要的是，相比于傳統的神經毒性模型和過表達AS的轉基因模型，利用AS原纖維建立的PD模型，所誘導產生的內源性AS的水平更接近于人類的生理水平并且其病理變化更類似于人類的病癥[8]。因此，利用AS原纖維建立PD模型，將有望成為研究體內PD樣LB病理學的通用造模方法。因此，本文就基于AS原纖維的帕金森氏疾病模型的研究進展進行綜述。

1 AS的結構及傳播

1.1 AS的結構

AS是一種由140個氨基酸殘基組成的蛋白質，分子量約為14 × 103。AS具有獨特的結構(如圖1)，其中1 ～ 60號殘基為N-末端(氨基端)，介導了AS與脂質膜的結合[9]；60 ～ 95號殘基為NAC結構域，該區域被認為是檢測AS聚集的重要指標[10]。1 ～ 95號殘基共同組成了脂質結合結構域，包括了7個11-mer(11個氨基酸殘基)的重復序列，KTKGEV為其共有序列，與載脂蛋白類似，形成兩個α-螺旋、三個轉角[9-10]。所有與突觸核蛋白病相關的已鑒定的突變位點都位于該區域：A30P、E46K、H50Q、G51D、A53E和A53T[11]。AS的96 ～ 140號殘基為C-末端(羧基端)，是高度酸性的不規則卷曲結構，也是各種翻譯后修飾的靶標[12]。C-末端是AS與各類蛋白質、離子、聚陽離子相互作用的部位，同時也調節了AS的膜結合，以及保護AS免于聚集[13]。

注：在與脂質膜結合后，AS的N-末端結構域折疊成兩個兩親性螺旋；AS的C-末端尾部不會促進膜結合。脂質結合結構域可以分成七個高度保守的11-mer序列。α-螺旋-2包含易聚集的NAC結構域。AS的所有疾病相關突變位于第二和第四11-mer伸展中。圖1 AS的結構域示意圖Note. Upon binding to the lipid membrane, the N-terminal domain of AS folds into two amphipathic helices; the C-terminal tail of AS does not promote membrane binding. The lipid binding domain can be divided into seven highly conserved 11-mer sequences. α-Helix-2 contains a cluster of NACs that are susceptible to aggregation. All disease-associated mutations in AS are located in the second and fourth 11-mer stretches.Figure 1 Schematic diagram of the AS domains

1.2 AS在體內的生理病理構象及傳播

正因為AS的結構特性，導致了其在體內的構象容易發生改變(如圖2)，AS的異常構象對于PD病理學的傳播和神經元功能障礙來說至關重要。AS本質上是一種無序的蛋白質，正常生理狀態下是自然伸展的單體形式，但是不同的環境條件會影響其構象的可塑性。AS單體在體內以兩種狀態存在，即可溶狀態(天然非結構化)和膜結合狀態(部分螺旋構象)。當體內環境改變時，天然非結構化的單體可以通過部分折疊的成核結構轉化為寡聚體，寡聚體最終會轉化為高度有序的β-折疊淀粉樣蛋白原纖維，但目前寡聚體的轉化機制尚不清楚[14]。天然非結構化蛋白質也會形成無序結構，這導致了其他無序聚集體的形成[15]。AS的這種聚集傾向正是導致PD的主要原因之一。另外，高度有序的AS原纖維具有類朊病毒樣傳播特性，會形成原纖維種子，在神經元細胞之間進行傳播[16]。

AS會在體內傳播的首次報道來自于一位有22年PD病史的患者，為了減輕紋狀體多巴胺的損失，其在1993年接受了6.5 ～ 9周齡的胚胎干細胞移植[17]。2008年，也是其移植手術的14年后，研究者們在其中腦黑質內新移植的神經元細胞中檢測出了LBs[17-18]。隨后，研究者們在小鼠體內對這一現象進行了驗證，發現注射了AS原纖維的小鼠腦內出現了大量具備PD病理特征的LBs樣包涵體[19]。已有研究表明，原纖維種子從一個細胞到另一個細胞的傳播可通過直接穿透、內吞作用或受體介導的轉運等多種方式發生[20-21]。最新研究表明，原纖維的生長和傳播在AS介導的細胞凋亡和細胞死亡中發揮著核心作用，研究如何抑制原纖維的生長傳播對PD和其他神經系統退行性疾病的治療有重要意義[22-23]。然而，驅動原纖維種子傳遞和增殖的生理化學條件以及控制體內聚集體生長和擴增速率的因子至今仍不清楚。

注：正常生理狀態下，細胞溶質中的AS是自然伸展的單體形式。在與突觸小泡結合后，AS發生錯誤折疊，N-末端殘基變為螺旋結構。病理狀態下，錯誤折疊的AS發生聚集形成具有細胞毒性的寡聚體，同時，AS會轉化為含β-折疊的原纖維，最終形成淀粉樣蛋白原纖維。AS原纖維會形成原纖維種子，在神經元細胞之間進行傳播，促進細胞內可溶性AS的合成。圖2 AS在體內的生理病理構象及傳播過程Note. Under normal physiological conditions, the cytosolic AS naturally occurs in the monomeric form. After binding to synaptic vesicles, AS misfolds and the N-terminal residue becomes a helical structure. Under pathological conditions, misfolded AS aggregates to form cytotoxic oligomers and is converted to β-sheet-containing fibrils, eventually forming amyloid fibrils. AS fibrils form fibril seeds that propagate between neuronal cells and promote the synthesis of soluble AS in cells.Figure 2 Physiological and pathological conformation and propagation of AS in vivo

2 基于AS原纖維的PD模型的研究進展

2.1 基于AS原纖維的細胞模型

基于AS原纖維的傳播特性，尤其能誘發一系列接近人生理病理的PD特征，采用AS原纖維制備各種細胞、動物模型成為了PD造模中的一大熱點。2009年，Luk等[24]首次將外源性的重組AS原纖維添加到過表達AS的哺乳動物細胞系內(QBI-HEK-293和SH-SY5Y)，建立了AS原纖維的細胞模型，發現觸發了細胞內可溶性的AS發生聚集，同時磷酸化和泛素化水平都上調。該AS原纖維的細胞模型概括了PD病人腦中LBs的關鍵特征。相比于傳統的PD神經毒性模型和過表達AS的腺相關病毒系統模型[25-26]，AS原纖維的PD細胞模型的優點是可以在培養的原代神經元中產生類似真正的路易體和路易神經突的包涵體。2011年，Volpicelli-Daley等[27]將外源性的AS原纖維接種于原代神經元細胞，發現誘導了路易體病變，并最終導致了突觸功能障礙和神經元死亡。隨后，其又發現AS原纖維會被神經元攝取，最終導致內源性的AS發生聚集并形成LBs，所產生的包涵體首先在軸突當中形成，然后逐漸擴散到體細胞和樹突當中[28]。更加有趣的是，AS原纖維也能被星形膠質細胞攝取(胞吞作用)，并且能夠在原代神經元細胞和星形膠質細胞之間進行傳播，對細胞造成毒性作用[29]。在接種外源性AS原纖維的原代神經元細胞中，外源性的AS原纖維誘導了內源性表達的AS形成包涵體，與人類的PD病理特征非常相似。同時，最新研究表明，AS原纖維對原代神經元的細胞毒性程度強于細胞系的毒性作用[30]。

由于AS原纖維獨特的傳播特性以及其能夠作為高效建立PD細胞模型的全新材料，越來越多的研究者開始對其進行深入的研究。2019年，Tanaka等[31]發現當AS發生自發聚集時，會形成不同結構的多態性原纖維；而將AS進行接種時，則會產生具有傳播特性的原纖維種子。在AS原纖維的PD細胞模型中，當原纖維接種于原代神經元7 d后，發現神經元中自發性的Ca2+瞬變的頻率和幅度都會減小[32]，并且當神經元還未死亡時，軸突中的內含物便會選擇性地損害攜帶TrkB受體和LC3陽性自噬體內體的軸突運輸，導致軸突轉運功能損傷[33]。該研究提示，神經毒性和突觸功能相關指標的監測可以作為PD風險防范的臨床前的診斷方式之一。

但是，AS原纖維究竟是通過什么途徑在細胞內發揮功能的，仍不清楚。最近，有研究者發現，小膠質細胞的自噬是由AS原纖維持續積累引起的溶酶體損傷引起的[34]。最新研究發現，內化的AS原纖維會導致溶酶體活性受損，但對蛋白酶體活性和線粒體在受體細胞中的穩態不會造成影響[35]。與此相反，也有大量研究表明，AS原纖維會優先與線粒體結合，最終導致線粒體功能障礙[36-37]。這些研究結果提示，或許可以將細胞器作為介入的靶點，進一步研究AS原纖維在PD中的作用機制。

2.2 基于AS原纖維的動物模型

正如上文所提到的，AS原纖維的PD細胞模型可以誘導產生類LBs和路易神經突的包涵體。隨后，研究者們將AS原纖維定位注射于小鼠(以及大鼠)腦內，發現小鼠的海馬、皮質、中腦以及其他的大腦區域的神經元中都出現了類LBs的包涵體[38-39]，這可幫助我們更好地去研究不同神經元群體的功能。因為不需要轉基因過表達人AS，所以相比于傳統的過表達AS的腺相關病毒系統模型[26]，利用外源性的AS原纖維建立PD動物模型的優點是可以直接利用基因敲除或轉基因小鼠研究任何我們感興趣的基因對聚集體形成的影響。

至今，越來越多的研究者通過實驗證實了該模型的有效性和可操作性。Paumier等與Suzukake等[38, 40]將超聲后的AS原纖維注射到小鼠(和大鼠)的紋狀體、SNpc、內嗅皮質，甚至是小鼠(和大鼠)的肌肉中，發現無論注射部位如何，AS包涵體不僅會在注射部位形成，同時也會出現在遠離注射部位的其他腦區，并且注射后4周，可檢測到小鼠30%的TH陽性神經元發生了損失(大鼠50%)，另外，即使當原纖維僅注射在紋狀體的單側且AS包涵體僅出現在注射側時，另外一側也能檢測出神經元損傷和功能障礙[38]。

利用這一模型，Tran等[41]發現使用針對病理性AS的抗體可以防止AS的擴散和毒性作用的產生。他們的研究發現，在接受原纖維注射的小鼠中，注射單克隆抗體減少了病理性AS的產生，并且SNpc中的多巴胺能神經元損失減少，運動行為也得到了改善[41]。因此，基于AS原纖維的PD動物模型的這些實驗證明了免疫療法有可能成為預防PD的全新療法。基于以上研究結果，Luan等[42]將AS原纖維模型用于研究慢性咖啡因的治療效果，發現慢性咖啡因治療降低了pSer129的聚集、神經元細胞的死亡以及小膠質細胞、星形膠質細胞的激活，并且還發現該治療可以選擇性地逆轉由AS誘導以及分子伴侶介導的自噬缺陷。這些發現提示了一種與環境因素相關的通過靶向自噬途徑來治療PD的新型藥理學療法。2019年，Bieri等[43]使用AS原纖維的PD模型，對與AS聚集有關的修飾物進行了與PD相關的風險基因的靶向遺傳篩選，發現LRRK2和GBA基因的表達下調，會促進小鼠原代神經元中的AS發生聚集；并且，在過表達與PD連鎖的LRRK2突變基因的小鼠中檢測到了AS的聚集。同時，也有研究者發現內源性LRRK2蛋白的減少，會降低該PD模型中AS包涵體的形成[44]。這些研究揭示了LRRK2蛋白在PD中的重要作用，并且提供了一種潛在的PD治療策略。

3 結語

總而言之，開發PD模型的目的是為了了解疾病是如何發展，以及如何采取有效的措施減緩或阻止疾病的發生。PD的AS原纖維模型概括了PD的許多特征：神經元丟失、具有生物化學和形態學特征的包涵體、類LBs和路易神經突、整個大腦的病理學擴散以及運動行為缺陷等[45-46]。另外，相比于傳統的PD神經毒性模型和過表達AS的腺病毒系統模型，PD的原纖維模型表現出了顯著的優越性[45, 47]。因此，基于AS原纖維的PD模型大大提高了我們對PD的理解。