兒童重癥肺炎鏈球菌肺炎的感染狀況、耐藥性及血清型研究

孔程祥　王飛玲　李莉　金萍　吳麗娟　謝紅波

【摘要】 目的：分析兒童重癥肺炎鏈球菌肺炎的感染狀況、血清學分型及耐藥現狀，為預防和控制肺炎鏈球菌感染提供依據。方法：回顧性分析2013年6月-2018年6月筆者所在醫院PICU收治的重癥肺炎鏈球菌肺炎患兒的臨床資料，進行病原菌培養及藥敏試驗，并采用多重PCR對肺炎鏈球菌血清型體系進行檢測。結果：共分離出肺炎鏈球菌86株（28.86%），位居首位;對抗菌藥物的耐藥率總體呈上升趨勢，對紅霉素、克林霉素、四環素、復方新諾明均有較高的耐藥性，多數肺炎鏈球菌對青霉素類、頭孢類藥物敏感，對萬古霉素、利奈唑胺的耐藥率為0，未發現對喹諾酮類藥物耐藥;血清學分型檢測以19F（29.07%）、23F（15.12%）、6型（15.12%）和19A（11.63%）為主。結論：肺炎鏈球菌仍是本地區兒童重癥肺炎的主要病原菌，耐藥問題日益顯著，應正確合理使用抗生素，有效提高兒童重癥肺炎的救治成功率。

【關鍵詞】 兒童; 重癥肺炎; 肺炎鏈球菌; 耐藥性; 血清型

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.20.021 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2019）20-00-03

Study on Infection Status，Drug Resistance and Serotype of Severe Streptococcus Pneumoniae Pneumonia in Children/KONG Chengxiang，WANG Feiling，LI Li，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2019，17（20）：-52

【Abstract】 Objective：To analyze the infection status，serological classification and drug resistance of severe Streptococcus pneumoniae infection in children，so as to provide evidence for the prevention and control of Streptococcus pneumoniae infection.Method：The clinical data of children with severe Streptococcus pneumoniae admitted to PICU from June 2013 to June 2018 were analyzed retrospectively.The pathogen culture and drug sensitivity test were carried out，and the serotype system of Streptococcus pneumoniae was detected by multiplex PCR.Result：A total of 86 strains（28.86%） of streptococcus pneumoniae was isolated，ranking the first.The drug resistance rate of antibiotics was on the rise，and erythromycin，clindamycin，tetracycline and SMZ were all highly resistant.Most streptococcus pneumoniae were sensitive to penicillin and cephalosporins，while vancomycin linezolid and quinolones had no resistance.Serotype was mainly composed of 19F（29.07%），23F（15.12%），type 6（15.12%），and 19A（11.63%）.Conclusion：Streptococcus pneumoniae is still the main pathogen of severe pneumonia in children in our region，and drug resistance is becoming increasingly significant.Therefore，antibiotics should be used correctly and rationally to effectively improve the success rate of treatment for severe pneumonia in children.

【Key words】 Children; Severe pneumonia; Streptococcus pneumoniae; Drug resistance; Serological typing

First-authors address：Shenzhen Baoan Maternal and Child Health Hospital，Shenzhen 518106，China

社區獲得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）是全球5歲以下兒童死亡的重要原因，細菌感染是主要原因之一，據統計，肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae，SP）是引起CAP的主要細菌。本文通過總結筆者所在醫院不同時期兒童重癥肺炎鏈球菌肺炎的感染狀況、細菌血清型，并分析其對抗菌藥物的耐藥性，為兒童重癥肺炎鏈球菌肺炎得到有效預防和治療，并減少多重耐藥菌株的產生提供有力依據，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2013年6月-2018年6月在筆者所在醫院PICU住院治療的469例兒童重癥肺炎患者為研究對象，所有患者均符合小兒重癥肺炎的診斷標準[1]。其中男320例，女149例，0～1歲339例，1～3歲93例，3～7歲34例，7歲以上3例。所有菌株均為連續分離的非重復株，同一患兒只取其第一次分離的菌株。

1.2 方法

1.2.1 標本采集和送檢 所有重癥肺炎患兒的痰（或肺泡灌洗液）標本均在患兒入住PICU并確診為重癥肺炎時采集。痰液標本采集前均給予清潔口腔后誘導吸痰，肺泡灌洗液的取材均為經消毒過的纖維支氣管鏡在無菌操作下取得，所有標本均裝入無菌痰標本杯內中密封送檢。

1.2.2 菌株的分離培養和鑒定 將采集的標本分別接種于哥倫比亞血瓊脂平板、嗜血巧克力平板和麥康凱平板上，放于35 ℃、5% CO2培養箱培養。對可疑肺炎鏈球菌菌落采用手工法奧普托欣試驗或質譜儀MALDI-TOF Biotyper（德國bruker公司）進行細菌鑒定。具體操作流程按照《全國臨床檢驗操作規程》執行。

1.2.3 藥敏試驗 肺炎鏈球菌采用Kirby-Bauer（K-B）法紙片擴散法對青霉素、頭孢曲松、萬古霉素、四環素、紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星和復方新諾明等抗菌藥物（英國OXOID公司產品）進行體外藥敏試驗，藥敏平板選用M-H血瓊脂平板（溫州市康泰生物科技有限公司產品），操作和結果判讀依據美國臨床實驗室標準委員會（clinical and laboratory standards institute，CLSI）每年更新的抗菌藥物敏感性標準。

1.2.4 血清學分型 采用多重PCR對SP血清型進行檢測，將凍存的SP菌種復蘇轉至哥倫比亞血平板（廣州迪景），置35 ℃、5% CO2溫箱培養24 h，獲得新鮮SP菌落。按以下步驟進行檢測：（1）引物設計。參照文獻[2]對PCR引物，包括SP莢膜多糖基因的保守序列cpsA，血清型4、6、9V、14、18、19A、19F、23F特異性引物，由Invitrogen公司合成。（2）DNA提取和PCR擴增。將新鮮純SP菌落刮入1 ml生理鹽水，按Axygen細菌基因組DNA小量提取試劑盒（柱提取法）步驟提取模板DNA。PCR反應體系為ExTaqDNA聚合酶0.1 μl，10×ExTaq buffer 2 μl，模板DNA 2 μl，dNTPs 1.6 μl，9種混合引物（每種引物200 μm）

0.75 μl，重蒸水補足至20 μl。循環參數：94 ℃ 15 min，94 ℃

30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環，72 ℃ 10 min。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠電泳成像系統觀察產物條帶。（3）DNA測序。在紫外燈下切割有條帶的膠塊，按DNA純化試劑盒說明書對DNA 進行純化后，按TA載體試劑盒說明書與pMD18-T載體進行連接，平板克隆。完成后送華大基因公司測序，測序結果經Blast檢索與GenBank數據庫進行同源性比較分析。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行數據分析，將所有數據錄入SPSS 22.0內，對其采用頻數分析法進行數據的統計與分析。

2 結果

2.1 肺炎鏈球菌檢出情況

469例患兒共采集標本1 185份，陽性標本273份，細菌檢出率為23.04%（273/1 185）;其中72份標本為肺泡灌洗液，

1 113份標本為痰液;少數標本查出混合菌感染，最終共培養出298株病原菌。其中前五位細菌分別為：肺炎鏈球菌（86/298，占28.86%）、流感嗜血桿菌（71/298，占23.83%）、金黃色葡萄球菌（39/298，占13.09%）、肺炎克雷伯菌（22/298，占7.38%）、大腸埃希菌（20/298，占6.71%）。其他細菌數量相對較少，分別為鮑曼不動桿菌（15/298，占5.03%）、銅綠假單胞菌（10/298，占3.36%）、卡他布拉漢氏菌（7/298，占2.35%）、陰溝腸桿菌（5/298，占1.68%）、洋蔥伯克霍爾德氏菌（5/298，占1.68%）、腸桿菌科（4/298，占1.34%）、產氣腸桿菌（3/298，占1.01%）;醫院不動桿菌、產酸克雷伯菌均只有2株（占0.67%）;而陰溝腸桿菌、坂崎腸桿菌、粘金黃桿菌、柯氏檸檬酸桿菌、腦膜炎敗血性黃桿菌、解尿氨酸克雷伯菌、糞腸球菌均僅有1株

（占0.34%）。

2.2 抗菌藥物耐藥性檢測結果

肺炎鏈球菌對紅霉素、克林霉素、四環素、復方新諾明均有較高的耐藥性，且呈逐年上升趨勢;多數肺炎鏈球菌對青霉素類、頭孢類藥物敏感，對萬古霉素、利奈唑胺的耐藥率為0，未發現對喹諾酮類藥物耐藥，見表1。

2.3 血清學分型結果

86株臨床分離的肺炎鏈球菌中，檢出19F最多，占29.07%（25株），其次為23F，占15.12%（13株），6型占15.12%（13株），19A型占11.63%（10株），其他為：15B型占4.65%（4株），14型占2.33%（2株），15A、18型、9V、4型各占1.16%（1株），另外檢出兩種血清型混合感染占11.63%（10株），未檢出相關血清型5.81%（5株）。

3 討論

肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae，SP）是人類最早認識的革蘭陽性雙球菌，人群對其普遍易感，全球兒童肺炎鏈球菌的感染率及感染相關病死率高。據報道，據世界衛生組織（WHO）估計，2008年全球5歲以下兒童死亡約880萬例，5%死于肺炎鏈球菌性疾病（pneumococcal diseases，PD）[3];2010年WHO估計全球全年5歲以下肺炎鏈球菌肺炎患兒共258.50萬例，占全球5歲以下肺炎患兒的18.30%，兒童肺炎鏈球菌肺炎現況不容樂觀。

本研究發現筆者所在醫院兒童重癥肺炎以肺炎鏈球菌感染為首，與陸蕓蕓等[4]報道的重癥肺炎患兒細菌檢出以流感嗜血桿菌為首不同，與劉霞等[5]報道的重癥肺炎患兒細菌檢出以肺炎克雷伯菌為首亦不相同，也不完全等同于De Schutter等[6]報道的肺炎以流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、肺炎鏈球菌為主要細菌病原，提示不同地域、不同病情，肺炎病原菌普可發生不同的變遷。準確掌握本地區重癥肺炎病原菌普的變遷情況，可指導臨床醫生選擇有效抗生素，有助于提高重癥肺炎的搶救成

功率。

通過本研究發現，肺炎鏈球菌對紅霉素、克林霉素、四環素、復方新諾明等藥物耐藥性較高，與李立群等[7]報道一致，也可能與大環內酯類藥物不合理使用有關。多數肺炎鏈球菌對青霉素類、頭孢類藥物還是比較敏感的，筆者尚未發現對萬古霉素、替考拉寧和利奈唑胺耐藥的菌株，與國內其他報道類似[8]。但國外Sanaei等[9]報道肺炎鏈球菌對萬古霉素的耐藥率為1.5%。總的來說，肺炎鏈球菌的耐藥菌率是呈上升趨勢的，臨床工作中應予以重視。

現實中肺炎鏈球菌存在90多種血清型，具有強大的致病力和定植力，決定血清型特異性的是其細胞外包繞的莢膜多糖，也是最重要的毒力因子和致病關鍵，可作為宿主抗體的作用靶點，這也是疫苗應用的基礎。肺炎鏈球菌的血清型與其致病性、耐藥性和疫苗有效性等均密切相關，是防治種肺炎鏈球菌相關性疾病（pneumococcal disease，PD）相關研究的核心。多項研究顯示肺炎鏈球菌多重耐藥菌在全球廣泛流行，亞洲國家最顯著，我國則高達80%～90%[10]。本研究發現，筆者所在醫院肺炎鏈球菌感染引起的兒童重癥肺炎，血清學分型以19F為主，這與陳巧君等[11]報道較為類似，也與歐美發達國家廣泛應用PCV疫苗之前的結果及亞洲多個國家監測結果相似[12]，但與王啟等[13]有關報道略有不同，與李曉等[14]有關報道亦有不同;Xue等[15]對中國兒童171株侵襲性肺炎鏈球菌菌株采用傳統方法檢測血清型結果顯示以19 F、14、19A、未檢出型、6、23F為主，與本文亦略有差異，這說明肺炎鏈球菌的血清型分布存在地區差異，具有區域性。可能與各地區人群的組成、疫苗的接種情況不同有關。

SP的血清型分布流行特點具有地域、年齡差別，并隨時間、環境變遷、人群流動、抗菌素壓力、細菌進化和重組等多種因素出現不同時期流行血清型的飄移[16]，因此，持續監測SP的血清型流行分布及改變特征，與研究SP的致病機制、耐藥性傳播、血清型置換等實驗和臨床研究都息息相關，對防治PD具有重要的流行病學意義。

綜上所述，肺炎鏈球菌仍是本地區兒童重癥肺炎的主要病原菌，血清型分類以19F為主，肺炎鏈球菌臨床耐藥問題值得大家關注，應提高肺炎鏈球菌的鑒定能力，及早發現，正確合理使用抗生素，有效提高兒童重癥肺炎的救治成功率。

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