3種抗HBV核苷(酸)類似物體外抗乙肝病毒作用

龔紅菲，龐富華，芮 瑩，韋 歐，韋京辰

3種抗HBV核苷(酸)類似物體外抗乙肝病毒作用

龔紅菲，龐富華，芮 瑩，韋 歐，韋京辰

（桂林醫學院 藥學院，廣西 桂林 541100）

比較3種抗HBV核苷（酸）類似物（拉米夫定、恩替卡韋、替諾福韋）對HepG 2.2.15細胞的毒性作用和對HBsAg、HBeAg和HBV-DNA表達的抑制效果。用四甲基噻唑藍（MTT）法檢測藥物的細胞毒性；酶聯免疫（ELISA）法檢測HBsAg 和HBeAg表達水平；PCR-熒光探針法定量檢測HBV-DNA含量。結果：在最高濃度200 mg/L時，拉米夫定組存活率為74.72%，恩替卡韋組存活率僅為36.74%，替諾福韋組存活率為95.22%；拉米夫定和替諾福韋對HBsAg、HBeAg表達無明顯抑制，恩替卡韋對HBsAg、HBeAg表達有抑制并與其細胞毒性相一致。在第9天，3種藥物對HBV-DNA抑制作用明顯，在6.25 mg/L濃度時，抑制率均高于90%；3種藥物在相同藥物濃度下，恩替卡韋對HepG 2.2.15細胞毒性最大，替諾福韋幾乎沒有細胞毒性，拉米夫定有一定毒性。

抗HBV核苷（酸）類似物；細胞毒性；HBsAg；HBeAg；HBV-DNA

乙型肝炎病毒（HBV）是一種全球常見的血液傳播病原體，某些患者可引起肝硬化和肝癌，甚至死亡[1]。目前，FDA批準了兩類抗病毒藥物用于治療乙型肝炎，即免疫調節劑（干擾素[IFN]-a和聚乙二醇化干擾素[PEG-IFN]-a）和核苷（酸）類似物（拉米夫定，替比夫定，阿德福韋，替諾福韋[TDF]和恩替卡韋[ETV]）。盡管核苷類似物具有良好的耐受性并表現出早期和強效的抗病毒作用，但在長期治療期間耐藥突變株的出現和腎毒性限制了其藥物的使用[2-4]。干擾素和核苷酸停藥后，往往又會檢測到HBV-DNA，即所謂的“反跳現象”[5]，這使得研究新型的抗乙肝病毒藥物顯得尤其重要。

目前，抗HBV治療缺乏特效藥，臨床常用的藥物對HbsAg、HbeAg和HBV-DNA僅有部分抑制作用，或抑制作用不強，抗乙肝病毒藥物研究具有很好的前景[6]。在抗HBV體外實驗中，陽性藥物的選擇和藥物濃度設定雜亂且效果參差不齊，缺乏可參照性。本文用臨床上抗HBV療效較好的3種核苷（酸）類似物體進行體外抗HBV實驗，摸索不同藥物濃度下其對抗原及HBV-DNA的抑制效果，為抗HBV藥物研究實驗中陽性藥的選擇和濃度設定提供參考。

1 材料

細胞株：HepG 2.2.15細胞由中國人民解放軍第302醫院提供，本室定期用G418篩選。

藥物與試劑：拉米夫定、恩替卡韋和替諾福韋(上海源葉)，G418（Gibco），DMEM（Gibco），胎牛血清（浙江天杭），青霉素-鏈霉素混合液（NOVON），胰蛋白酶-EDTA消化酶（Solarbio），PBS（Solarbio），HBsAg，HBeAg試劑盒（上?？迫A），乙型肝炎病毒核酸測定試劑盒（中山大學達安基因）。

2 儀器與設備

CO2培養箱（SANYO），超凈工作臺（天津市塵埃凈化設備廠），倒置顯微鏡（上海蔡康），酶聯免疫檢測儀（BioTek），熒光定量PCR儀（基因有限公司），細胞培養瓶（Corning）,96孔板（Corning）。

3 方法

3.1 3種抗HBV核苷（酸）類似物的配置

將拉米夫定、恩替卡韋、替諾福韋溶于DMSO后加入無血清DMEM培養液，混勻，配制成2 mg/L培養液；用含10% DMSO的DMEM培養液按梯度稀釋法，稀釋成質量濃度為1000、500、250、125、62.5 mg/L的樣品溶液。

3.2 細胞培養

將HepG 2.2.15細胞以1×104/mL接種于96孔板，置于37 ℃、5%的CO2培養箱培養24 h后，細胞貼壁且狀態良好，去除原有培養基，加入180 μL完全培養基，再加入20 μL上述藥物稀釋液（藥物終質量濃度為200、100、50、25、12.5、6.25 mg/L），每3 d更換相同培養基和藥液。同時設置無藥物的陰性對照組，收集上清液置–20 ℃保存待測。

3.3 四甲基噻唑藍（MTT）法檢測細胞毒性

第9天收集上清后，96孔板中每孔加入完全培養基100 μL和20 μL MTT，置于培養箱內培養4 h后，去除上清，加入100 μL DMSO，置搖床輕輕振蕩10~15 min，用酶標儀在490 nm處讀取吸光度OD值，根據以下公式計算細胞存活率：

細胞存活率=（實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%

3.4 酶聯免疫（ELISA）法檢測HBsAg和HBeAg表達的抑制率

將第3、6、9天的上清液按HBsAg和HBeAg試劑盒說明書操作，用酶標儀在450 nm讀取吸光度OD值，根據以下公式計算HBsAg和HBeAg的抑制率：

抑制率/%=[（對照組平均OD值–實驗組平均OD值）÷對照組平均OD值]×100%

3.5 PCR-熒光定量法定量檢測HBV-DNA

將第3、6、9天的上清液根據乙型肝炎病毒核酸測定試劑盒（PCR-熒光探針法）說明書步驟操作，使用熒光定量PCR儀進行PCR擴增，檢測其熒光信號，依據預循環值（q值）實現對未知樣本的定量檢測。

3.6 統計學處理

用SPSS 23.0統計軟件進行分析，OD值用均數±標準差（ˉ±s）表示，實驗數據采用重復測量方差分析，<0.05為差異有統計學意義。

4 結果

4.1 對HepG 2.2.15細胞毒性

MTT結果顯示：與陰性對照組相比較，在最高質量濃度為200 mg/L時，拉米夫定組存活率為74.72%，恩替卡韋組存活率僅為36.74%，替諾福韋組存活率為95.22%，3種藥物在相同藥物濃度下，恩替卡韋 對HepG 2.2.15細胞毒性最大，而替諾福韋幾乎沒有細胞毒性；拉米夫定有一定毒性，介于二者之間，詳見 表1。

表1 3種抗HBV核苷（酸）類似物對HepG 2.2.15細胞的毒性作用

注：*者表示與陰性對照組比較<0.05。

4.2 對HepG 2.2.15細胞HBsAg和HBeAg表達的抑制

與陰性對照組相比，拉米夫定及替諾福韋對HepG 2.2.15細胞的HBsAg、HBeAg表達無明顯抑制；恩替卡韋對HBsAg、HBeAg表達有抑制，并與其細胞毒性相一致，且呈現明顯的時間依賴性和濃度依賴性抑制，在第9天達到峰值，詳見表2和表3。

表2 3種抗HBV核苷（酸）類似物對HepG 2.2.15細胞HBsAg表達的影響

注：*者表示與陰性對照組比較<0.05。

表3 3種抗HBV核苷（酸）類似物對HepG 2.2.15細胞HBeAg表達的影響

注：*者表示與陰性對照組比較<0.05。

4.3 對HepG 2.2.15細胞HBV-DNA表達的抑制

從表4可知，3種抗HBV核苷（酸）類似物（拉米夫定、恩替卡韋、替諾福韋）在設定的質量濃度范圍內，均有良好的體外抑制HBV-DNA作用，在第9天，在6.25 mg/L濃度時抑制率均高于90%。

表4 3種抗HBV核苷（酸）類似物對HBV-DNA 的抑制作用

注：*者表示與陰性對照組比較<0.05。

5 討論

核苷（酸）類似物主要通過抑制病毒的反轉錄和DNA合成發揮抗病毒作用。拉米夫定通過抑制HBV-DNA多聚酶活性來治療乙型肝炎病毒[7]，而對病毒mRNA無作用, 為中國臨床上抗乙肝的一線藥物[8]。恩替卡韋是繼拉米夫定后的第二個獲得批準上市并用于治療慢性乙型肝炎的核苷類似物，對于初治患者及拉米夫定治療失效患者均具有明顯的抗HBV作用[9]。替諾福韋是替諾福韋-5-單磷酸腺苷類似物脂類的前體藥，該藥作用機理和恩替卡韋是一致的，均是進入人體后被體內細胞激酶磷酸化，之后生成替諾福韋二磷酸而發揮其藥效，二磷酸能夠與體內5-三磷酸脫氧腺苷酸競爭性參與乙肝病毒的合成，其抗HBV活性良好，并具有顯著的基因屏障作用[10-12]。

本研究中，在相同的藥物濃度下，恩替卡韋對HepG 2.2.15細胞毒性最大，替諾福韋幾乎沒有細胞毒性，拉米夫定有一定毒性。在細胞存活率大于70%時，3種藥物對HBsAg和HBeAg表達無明顯抑制作用，均通過抑制HBV-DNA復制來治療乙型肝炎病毒。因此，在抗HBV體外實驗中，如果選擇拉米夫定和替諾福韋作為陽性藥，因其對細胞的增殖影響不大，且在6.25 mg/L時對HBV DNA仍有很強抑制作用，可選擇的濃度范圍比較廣；而恩替卡韋對細胞增殖抑制作用比較強，質量濃度為6.25 mg/L時對細胞抑制為76.48%，增加濃度則對細胞抑制更明顯。為避免出現抑制細胞而抑制DNA表達的現象出現，影響科研實驗的對比，選擇恩替卡韋作為陽性藥時，藥物質量濃度設定低于6.25 mg/L更為合理。用HepG 2.2.15細胞進行體外抗HBV實驗，應結合藥物對HepG 2.2.15細胞的毒性作用，在不影響細胞增殖同時又能抑制HBsAg、HBeAg或HBV DNA表達，陽性藥設定合適的藥物濃度范圍更具有可比性和科學性。

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Effect of three anti-HBV nucleoside (acid) analogues on hepatitis B virus in vitro

GONG Hongfei, PANG Fuhua, RUI Ying, WEI Ou, WEI Jingchen

(College of Pharmacy, Guilin Medical University, Guilin 541100, China)

The comparison on the toxicity of three anti-HBV nucleoside (acid) analogues (lamivudine, entecavir and tenofovir) on HepG 2.2.15 cells and their inhibitory effects on the expression of HBsAg, HBeAg and HBV-DNA is carried out Tetramethylthiazole blue (MTT) assay is used to detect the cytotoxicity of drugs, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is adopted to detect the expression level of HBsAg and HBeAg, and quantitative detection of HBV-DNA content by PCR-fluorescence probe is conducted. The results are that at the highest concentration of 200 mg/L, the survival rate of lamivudine group is 74.72%, the survival rate of entecavir group is 36.74%, and the survival rate of tenofovir group is 95.22%. Lamivudine and tenofovir don’t inhibit the expression of HBsAg and HBeAg, but entecavir has inhibited the expression of HBsAg and HBeAg, which is consistent with their cytotoxicity. In the 9th day of PCR experiment, the inhibition of HBV-DNA by three drugs is obvious, and at 6.25 mg/L concentration, the inhibition rate is higher than 90%. Under the same concentration of three drugs, entecavir has the greatest cytotoxicity to HepG 2.2.15, tenofovir had almost no cytotoxicity, lamivudine had certain toxicity.

anti-HBV nucleoside (acid) analogues; cytotoxicity; HBsAg; HBeAg; HBV-DNA

R965.1

A

1002-4956(2019)09-0045-04

2019-02-23

國家自然科學基金項目（81560574）資助

龔紅菲（1993—），女，廣西興業，在讀碩士研究生，研究方向為抗腫瘤抗病毒藥理。

E-mail: 850699627@qq.com

韋京辰（1976—），女，廣西桂林，碩士，副教授，研究方向為抗腫瘤抗病毒藥理研究。

E-mail: 82579354@qq.com

10.16791/j.cnki.sjg.2019.09.012