液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定血液中鄰苯二甲酸酯

宋小飛，施召才，馬偉文，銀玉容，史 偉

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定血液中鄰苯二甲酸酯

宋小飛，施召才，馬偉文，銀玉容，史 偉

（華南理工大學(xué) 環(huán)境與能源學(xué)院廣東 廣州 510006）

研究了加速溶劑萃取（ASE）/液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定血液中鄰苯二甲酸單酯。血液樣品經(jīng)過冷凍干燥，利用加速溶劑萃取的方法，最后使用液相色譜-質(zhì)譜儀分析檢測PAEs成分。該方法的回收率為72.1%~136%；檢出限為1.47~12.3 ng/L。通過對珠三角地區(qū)的成年男性采集的血液分析，發(fā)現(xiàn)除MBzP外，血液中其他m-PAEs的均有檢出。血液中?8m-PAEs的質(zhì)量濃度為（26.1±57.3 ng/g）。血液中以MBP、MiBP、MEHP和MnOP為主，分別占血液中m-PAEs濃度的36.7%、23.2%、15.1%和13.2%。

快速溶劑萃取；液相色譜-質(zhì)譜；鄰苯二甲酸酯

鄰苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）是一類內(nèi)分泌干擾物，具有類雌激素作用和抗雄激素作用，可干擾機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致生殖發(fā)育系統(tǒng)異常，并且具有一定的肝臟毒性和致癌作用[1-3]。PAEs 可通過呼吸道、消化道和皮膚等途徑進(jìn)入人體，并在體內(nèi)發(fā)生代謝[4-6]。目前，PAEs人體內(nèi)暴露評價普遍采用體內(nèi)鄰苯二甲酸酯代謝物作為生物標(biāo)志物，對人體中鄰苯二甲酸酯代謝物的研究將為PAEs的暴露評價提供重要信息[7]。

目前，環(huán)境中的PAEs含量分析方法比較多[8-19]，但是關(guān)于人體血液中的含量研究則相對較少。研究表明，PAEs作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，其對動物機(jī)體，尤其對于雄性個體具有生殖發(fā)育毒性和內(nèi)分泌干擾作用，且具有致癌性和致突變性[20]。因此，建立一種簡單、快速測定人血液中的痕量的PAEs 的分析方法具有很重要的意義。本研究采用樣品冷凍干燥、ASE快速溶劑萃取的方式處理樣品，使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)，檢測血液樣本中的8種鄰苯二甲酸單酯（mono-PAEs或m-PAEs），以分析珠三角地區(qū)成年男性血液中PAEs暴露水平。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

儀器：1200-QQQ6410B液體相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent，美國）；ASE-150快速溶劑萃取儀（DIONEX，美國）；4KBTXL-75冷凍干燥機(jī)（VirTis，美國）；AD A10超純水儀（Millipore，美國）。

試劑：m-PAEs標(biāo)準(zhǔn)品：MMP、MEP、MBP、MiBP、MBzP、MHP、MEHP、MnOP（Aldrich，美國）；回收率指示物：D4-MnBP（Aldrich，美國）；甲醇、醋酸、正己烷和丙酮（色譜純，CNW，美國）；硅藻土（DIONEX， 美國）

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；ODS Hypersil預(yù)處理柱（2.1 mm×10 mm，5 μm）；流速：0.5 mL/min。流動相：體積分?jǐn)?shù)為0.01%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）。流動相梯度：0~5 min 50%A；5~6 min 50%~40%A；6~12 min 40%A；12~12.5 min 40%~15%A；12.5~20 min 15%A；20~20.5 min 15%~50%A；20.5~25 min 50%A。柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源電噴霧式離子源（electrospray ionization，ESI），負(fù)離子掃描模式；監(jiān)測方式為多重反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；離子源電壓（噴霧電壓）為–4000 V；干燥氣為氮?dú)猓魉贋? mL/min，溫度350 ℃；霧化器壓力2.4′105Pa（35 Psi）；碰撞氣為氮?dú)狻?/p>

1.3 樣品前處理

（1）冷凍干燥。采集的血液樣品保存于超低溫冰箱（–80 ℃）中，取出后拿下蓋子，用錫箔紙包好杯口，用針在錫箔紙上均勻扎孔；放入完成預(yù)冷的冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行冷凍干燥，干燥24 h，完成干燥后取出樣品，凍干率11.12%；保存于超低溫冰箱（–80 ℃），待分析。

（2）ASE萃取方法。準(zhǔn)確稱取生物樣品于萃取池中，加入PAHs回收率指示物。ASE提取條件：第一步：溫度100 ℃，壓力1.034′107Pa（1 500 Psi），甲醇靜態(tài)提取1個循環(huán)，循環(huán)持續(xù)5 min，以池體積60%的溶劑量沖洗提取池，氮?dú)獯祾?0 s；第二步：溫度100 ℃，壓力1.034′107Pa（1 500 Psi），正己烷-甲醇（體積比為1∶1）靜態(tài)提取3個循環(huán)，循環(huán)持續(xù)5 min；以池體積60%的溶劑量沖洗提取池，氮?dú)獯祾?0 s；合并萃取液，洗脫液氮?dú)獯蹈桑状级ㄈ葜?00mL，LC-MS分析。

1.4 質(zhì)量控制與保證（QA/QC）

在優(yōu)化條件下，分別測定不同濃度的m-PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，采用外標(biāo)法定量。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以信噪比為3 時的對應(yīng)濃度作為方法的檢出限（limit of detection，簡稱LOD），以信噪比為10 時的對應(yīng)濃度作為方法的定量限（limit of quantification，簡稱 LOQ），根據(jù)低水平空白加標(biāo)樣品6 次平行分析結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算獲取m-PAEs 的方法相關(guān)系數(shù)，檢出限和定量限。

取一定量生物樣品，分別加入不同濃度的m-PAEs標(biāo)準(zhǔn)混合溶液以及相應(yīng)量的回收率指示物，在確定的分析條件下，平行測定6次，計(jì)算m-PAEs及其m-PAEs回收率指示物的回收率與精密度。

2 結(jié)果與討論

2.1 m-PAEs特征離子和定量離子和總離子流色譜圖

m-PAEs對應(yīng)的特征離子和定量離子見表1，m-PAEs標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流色譜圖見圖1。

表1 m-PAEs質(zhì)譜分析條件

2.2 方法線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

在確定的實(shí)驗(yàn)條件下，方法線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。由表2可知，m-PAEs在0.01~250 ng/g范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9996~0.9999；方法檢出限為1.47~12.3 ng/L，定量限為4.41~36.9 ng/L。

圖1 m-PAEs總離子流色譜圖

表2 m-PAEs方法的線性范圍和檢出限

2.3 方法回收率和精密度

加標(biāo)回收率結(jié)果見表3。由表3可知，生物樣品中的m-PAEs的回收率在72.1%~136%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差2.05%~4.53%。

表3 m-PAEs方法的回收率

2.4 實(shí)際樣品分析檢測

2.4.1 珠江三角洲地區(qū)人群血液中m-PAEs的暴露水平

珠江三角洲地區(qū)人群血液中8種m-PAEs的質(zhì)量濃度見表4，血液中?8m-PAEs的質(zhì)量濃度為1.87 ng/g~551 ng/g，中值為13.2 ng/g，平均質(zhì)量濃度為（26.1±57.3）ng/g。血液中除鄰苯二甲酸芐基酯（MBzP）外，MMP、MEP、MBP、MiBP、MHP、MEHP和MnOP都能被檢出。

表4 血液中m-PAEs濃度 ng×g-1

注：ND表示未測出.

2.4.2 珠江三角洲地區(qū)人群血液中m-PAEs的組成特征

珠江三角洲地區(qū)人群血液中m-PAEs的組成特征如圖2所示。由圖2可知，血液中除MBzP未檢出外，血液中MBP含量最高（36.7%）， MiBP次之（23.1%）， MEHP和MnOP的含量也較高。

圖2 血液中8種m-PAEs含量比例

3 結(jié)論

珠江三角洲地區(qū)人群血液中?8m-PAEs的質(zhì)量濃度為1.87 ng/g~551 ng/g，中值為13.2 ng/g，平均濃度為（26.1 ± 57.3） ng/g；血液中以MBP、MiBP、MEHP、MnOP為主要m-PAEs，在血液中的含量分別為36.7%、23.2%、15.1%、13.2%。血液中MBP含量>MiBP含量> MEHP含量>MnOP含量>MMP含量>MEP含量> MHP含量，MBzP未檢出。

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Determination of phthalate esters in blood by liquid chromatography-mass spectrometry

SONG Xiaofei, SHI Zhaocai, MA Weiwen, YIN Yurong, SHI Wei

(School of Environment and Energy, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)

The determination of monophthalate in blood by accelerated solvent extraction (ASE)/liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) is studied. Blood samples are freeze-dried and extracted by accelerated solvent, and finally, PAEs are analyzed by the liquid chromatography-mass spectrometry. The recovery of this method is from 72.1% to 136%, and the detection limit is from 1.47 ng/L to 12.3 ng/L. Blood samples collected from adult males in the Pearl River Delta are analyzed, and it is found that all m-PAEs are detected except MBzP. The concentration of?8m-PAEs in blood is (26.1+57.3 ng/g). MBP, MiBP, MEHP and ManOP are the main components in blood, accounting for 36.7%, 23.2%, 15.1% and 13.2% of m-PAEs concentration respectively.

accelerated solvent extraction; liquid chromatography-mass spectrometry; phthalate esters

R331.1；0657.63

A

1002-4956(2019)09-0053-04

2019-01-08

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（B6160760）

宋小飛（1980—）男，陜西西安，博士，高級實(shí)驗(yàn)師，主要從事環(huán)境監(jiān)測和環(huán)境健康研究。

施召才（1982—）男，廣東饒平，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)榄h(huán)境監(jiān)測和健康研究。

E-mail: zcshi@scut.edu.cn

10.16791/j.cnki.sjg.2019.09.014