葉綠素熒光分析技術在實驗教學中的應用

班宜輝，徐舟影，李 靜，李 媛，陳碧峰，李俊麗，謝 浩

葉綠素熒光分析技術在實驗教學中的應用

班宜輝1，徐舟影2，李 靜1，李 媛1，陳碧峰1，李俊麗1，謝 浩1

（1. 武漢理工大學 化學化工與生命科學學院，湖北 武漢 430070；2. 武漢理工大學 土木工程與建筑學院，湖北 武漢 430070）

植物光合作用是植物生理學及相關課程的重要研究內容，而葉綠素熒光分析技術是快速、準確探測植物生理狀況的重要技術手段。該文設計了綜合性設計性實驗項目“利用葉綠素熒光分析技術研究不同溫度和水分條件對植物光合作用的影響”，研究不同溫度和水分脅迫對植物光合特性的影響。該實驗項目的實施，能夠使學生熟悉調制葉綠素熒光儀的工作原理，掌握葉綠素熒光分析技術，從而提高學生獨立開展科研項目的能力以及創新意識和創新能力。

葉綠素熒光分析技術；光合作用；溫度脅迫；水分脅迫

光合作用是全球碳循環的驅動因子，是地球上絕大部分生命得以維系的物質來源，是植物重要的生理過程。光合作用相關參數測定和分析，一直是植物生理學相關實驗課程的重點內容[1]。葉綠素熒光與植物光合作用關系密切，是植物葉綠素吸收能量后釋放的一種長波信號，包含了十分豐富的光合作用信息,使用特定的熒光參數可估算線性電子傳遞速率、同化速率以及光合系統熱耗散的變化[2-4]。因此，作為體外快速無損害檢驗光合作用的探針，葉綠素熒光常常被用于監測植物光合器官運轉情況，可以通過對體內葉綠素熒光參數的測定來反映多種逆境因子對植物光合作用的影響[5-6]。溫度和水分脅迫是最常見的植物脅迫因子，不適的溫度條件勢必會影響植物的光合效率，更易發生光抑制現象[7-8]，水分脅迫則可抑制光合作用光反應中的光能轉換、電子傳遞、光合磷酸化和光合作用暗反應等一系列過程, 導致光合速率下降，破壞光合作用進程[9]。

雖然葉綠素熒光被廣泛應用于光合作用監測，葉綠素熒光參數也很容易測得，但葉綠素熒光分析技術大多用于科研領域，學生在實驗教學環節很少有機會接觸和掌握這一技術。為使學生了解并掌握這項在植物生理學研究中廣泛應用的先進技術，設計了“利用葉綠素熒光分析技術研究不同溫度和水分條件對植物光合作用的影響”綜合實驗，采用以學生自我訓練為主的教學模式，培養學生數據分析和處理能力，提高學生創新思維，為探究影響光合作用強度的因素提供更多的實證數據。

1 實驗材料與儀器

1.1 植物材料

植物材料為玉米（L.），品種為鄭單958。選取大小一致的種子，用1%次氯酸鈉表面消毒5 min，無菌水沖洗3遍，放入無菌培養皿中于25 ℃培養箱中催芽，挑取發芽一致的種子備用。

1.2 主要儀器

便攜式調制葉綠素熒光儀（德國Walz，MiniPAM）、高壓蒸汽滅菌器（日本TOMY，SX-500）、人工氣候箱（上海精宏，RQH-250）。

2 實驗設計與方法

2.1 實驗設計

實驗采用室內盆栽培養方法，培養基質為蛭石，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌1 h。冷卻后裝盆，塑料盆直徑20 cm，高15 cm，每盆裝0.8 kg。移栽大小一致的玉米幼苗，放置在光照培養箱內培養，培養條件為25 ℃（晝）/18 ℃（夜）、光照強度500 μmol/（m2?s）、每天光照時數10 h。每周澆 Hoagland's 營養液[10]，每盆100 mL，配方為10 μmol/L H3BO3、6 mmol/L KNO3、8 mmol/L Ca(NO3)2、1 mmol/L NH4H2PO4、2.6 mmol/L MgSO4、0.5 μmol/L CuSO4、1.0 μmol/L ZnSO4、1.6 μmol/L MnSO4和(NH4)Mo2PO4及2 μmol/L Fe-EDTA，用1 mol/L HCl調節pH為6.5。培養15天后，開始進行水分脅迫和溫度脅迫。

實驗設置6 ℃為低溫脅迫（low temperature stress，LTS）、36 ℃為高溫脅迫（high temperature stress，HTS）及對照（CK，25 ℃）等3種溫度處理。設置3種水分條件，設定基質含水量占田間持水量的80%為對照（CK），60%為輕度脅迫（light water stress，LWS），30%為重度脅迫（severewater stress，SWS），采用稱重法控制基質水分。所有處理均重復5次。脅迫進行1周后測定葉綠素熒光參數。

以上實驗設計為教師在示范教學時采用的脅迫梯度及標準，學生在分組實驗時可自行設定溫度和水分的脅迫濃度，并可自主選擇脅迫時間，以充分調動學生積極性、鍛煉自主科研能力，各小組還能在數據處理時進行對比分析，從而得出準確、可靠的實驗結論。

2.2 葉綠素熒光參數的測定

使用便攜式調制葉綠素熒光儀（Mini PAM）于上午9：00–10：00測量玉米幼苗完全展開的第2片葉的葉綠素熒光參數。測定前先將玉米幼苗放在黑暗環境中暗適應20 min左右，測試時記錄初始熒光（0）、暗適應的最大熒光（m）、穩態熒光（t）、作用光關閉時的原初熒光（0?）、作用光打開時的最大熒光（?m）。測量時，首先用測量光（<0.1 μmol/(m2?s)）激發葉綠素的本底熒光測定0，再打開一次飽和脈沖光（光子通量密度PFD為8000 μmol/(m2?s)，頻率為20 kHz，1個脈沖時間為0.8 s），測定m以及v/m，然后打開作用光（PFD約為336 μmol/(m2?s)，白光）測定光下穩態熒光Ft，再打一次飽和脈沖光測定F?m，關閉作用光，繼以一次遠紅外光（PFD約為5 mol/(m2?s)，3 s）測定0?[11]。最小熒光、最大熒光、實時熒光測定各處重復5次。根據以下公式計算相關參數：

（1）PSII最大量子產量v/m=(m?0)/m；

（2）PSII實際光化學量子產量(II)=(?m?t)/?m；

（3）光化學熒光淬滅系數qP=(?m?t)/(?m?0)；

（4）非光化學熒光淬滅NPQ=(m?m)/?m；

2.3 數據處理和統計學分析

采用Excel 2016和SPSS 19.0軟件進行數據的統計分析，采用SigmaPlot 12.0進行圖形制作。數據為5次重復的平均值±標準偏差（SD），組間比較采用方差分析檢驗，以<0.05為差異有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 不同溫度對玉米葉綠素熒光參數的影響

3種溫度下玉米葉綠素熒光參數v/m、(II)、qP、NPQ的變化見圖1。v/m、(II)、qP等3個參數在25 ℃條件（CK）下數值最高，其次是高溫脅迫（HTS），低溫脅迫（LTS）下數值最低，且不同條件下的差異均達到了顯著性（<0.05）。三種溫度條件下的NPQ的數據顯示，低溫條件下玉米NPQ值達到2.33，分別是對照和高溫脅迫下的1.87和1.29倍，差異顯著（<0.05）。實驗數據表明，高溫或低溫脅迫均會對玉米光合系統造成顯著性影響，電子傳遞速率降低，光能利用率下降。與高溫脅迫相比，低溫條件對玉米光合作用效率的抑制作用更加顯著。

3.2 不同水分條件對玉米葉綠素熒光參數的影響

不同程度水分脅迫下玉米葉綠素熒光參數v/m、(II)、qP、NPQ的變化如圖2所示。3種水分條件下v/m、(II)、qP等3個參數的數值變化表現為，正常水分（CK）>輕度脅迫（LWS）>重度脅迫（SWS），且差異均達到了顯著水平（<0.05）。重度水分脅迫對(II)和qP的影響更為明顯，與對照相比，在重度脅迫下(II)和qP的數值分別下降了51.8%和51.0%。3種水分條件下的玉米NPQ的數據顯示，輕度水分脅迫增加了熱能的損耗，與對照相比提高了17.8%，但二者差異不顯著（>0.05），重度水分脅迫下NPQ值是對照的1.5倍，差異顯著（<0.05）。由實驗數據可知，輕度或重度水分脅迫均會抑制玉米光合作用活性，且重度脅迫顯著增加了熱耗散，降低了植物的光化學效率，對光合作用的抑制更為顯著。

圖1 溫度脅迫對玉米葉綠素熒光參數的影響

圖2 水分脅迫對玉米葉綠素熒光參數的影響

4 實驗教學探討

4.1 教學效果評價

在植物生理學相關課程中，對植物光合作用的常規測定主要包括測定植物葉面積、葉綠素含量、Mg2+含量等，這些很難準確、快速地反映植物光合特性，更無法依此評價環境因素對植物光合作用的影響。葉綠素熒光分析具有測量快速、準確可靠、原位測量等優點，可以在不破壞葉片的前提下了解葉片內部光合作用過程的變化，判斷植物光合特性、受脅迫狀態、光保護能力等[12]。

（1）便攜式調制葉綠素熒光儀可以實時監測葉綠素熒光參數的變化，從實驗開始直至實驗完成都在采集熒光數據，且一直處于動態變化過程中。學生可以根據圖譜變化實時了解植物光合作用狀態，教師可以根據實驗數據的變化，隨時提出問題，引導學生進行分析和討論。學生在此過程中既能了解儀器的工作原理和操作方法，也能通過分析參數的變化，理解不同參數與植物光合活性的關系。

（2）葉綠素熒光儀在植物光合作用測定中的應用，增加了實驗過程的“可視性”。借助于熒光儀將“不可視”的熒光信號的變化轉換為“可視”的實驗數據，并以動態曲線的方式呈現在計算機上，實驗結果更加清晰明了，給學生以直觀的印象，更能加深學生對植物光合作用過程的理解，并明確葉綠素熒光在植物光合作用中的作用及意義。

（3）葉綠素熒光儀對熒光信號的采集非常靈敏，在動態檢測光合作用過程中對微小量的變化都可以檢測出來，實現了實驗變量的定量檢測，增強了實驗結果的準確度。與以往光合作用測定方法相比，數據可信度更高。

（4）以往對植物光合作用的測定過程比較繁瑣，需要配制相應的試劑，測定過程耗時較長。葉綠素熒光參數的測定過程可以在短時間內完成，實時收集 數據，大大縮短了實驗學時，而實驗教學質量卻明顯提高。

4.2 葉綠素熒光參數的選擇

由于葉綠素熒光反應的過程是光合電子傳遞鏈中能量平衡的過程，對操作環境及植物生長狀態十分敏感，因此在應用這些葉綠素熒光參數來診斷脅迫因素對植物光合作用的影響時，容易受到許多潛在干擾因素的影響，必須謹慎使用不同的葉綠素熒光參數組合[13]。

在諸多葉綠素熒光參數中，Fv/Fm、Y(II)、qP和NPQ是最為常用的參數組合，能夠綜合反映脅迫下植物光合特性的變化。Fv/Fm的大小表示PSII受傷害的程度；Y(II)反映了光合鏈上電子傳遞的速率；qP表示葉綠素吸收的光能用于光化學反應的大小，也可表示PSII將光能轉變為電勢能的能力；NPQ是非光化學熒光淬滅系數，它的大小表示葉綠體吸收來的光能以熱能形式散去的部分，在強光下它對保護PSII的結構有重要作用[14]。

4.3 實驗注意事項

（1）植物種類的選擇及植物幼苗的均一性。調制葉綠素熒光儀的葉夾是固定植物葉片的裝置，上下兩部分打開后可以夾住葉片，夾子上面部分提供了一個直徑為1 cm的圓形測量孔。因此，為了達到較好的實驗效果，實驗教學用的植物材料應選擇葉片較大、生長較快的植物，以保證熒光信號的采集不受影響。另外，為了保證植物材料的均一性，應選擇育苗時間相同、大小一致的植物幼苗進行后續實驗，以減小植物個體差異對實驗數據的影響。

（2）葉片的選擇。許多研究表明，植物不同葉位葉片及同一葉片不同部位的光合速率存在很大的差異，而且不同葉片的著生角度（平展和直立）或取向也對葉片的光合速率有影響。因此，實驗中在作對比測定時一定要充分注意所測植物葉片的葉位、葉取向和葉部位等葉片諸多因素的一致性和可比性[15]。由于完全展開的葉片的光合活力最高，因此本實驗項目以玉米幼苗完全展開的第2片葉作為樣品葉。如果忽略葉片在光合速率上的差異性，會引起較大的實驗誤差。

（3）植物培養過程中要考慮“邊緣效應”的影響。本實驗中，植物材料的培養在光照培養箱中進行，不同位置（中央位置與周邊部分）植物所受的光照強度、溫度、濕度等因素略有差異。為了盡量避免其他因素對實驗結果的影響，提高實驗的準確度，植物培養過程要適時調整植物幼苗在光照培養箱中的位置，消除“邊緣效應”的影響。

（4）葉綠素熒光參數測定的時間要求。葉綠素熒光參數的測定要充分考慮植物光合作用的規律，在植物光合作用活性較高的上午9：00–11：00時測定的熒光參數，才能最準確地反映植物光合作用效率。

5 結語

葉綠素熒光作為光合作用的探針，得到了廣泛的研究和應用。植物光合作用的所有變化過程均可通過葉綠素熒光參數的變化反映出來，而葉綠素熒光分析技術采取原位測定的方法，不破壞植物體完整性，不損傷細胞。因此，通過研究葉綠素熒光來間接研究光合作用的變化是一種簡便、快捷、準確的方法。

本文利用葉綠素熒光儀的上述特點，結合植物生理學等課程的實驗要求，設計了“利用葉綠素熒光分析技術研究不同溫度和水分條件對植物光合作用的影響”綜合實驗。通過該實驗項目的實施，既能夠使學生熟練掌握葉綠素熒光分析技術，了解不同環境條件對葉綠素熒光的作用效果，又能夠實現以學生自我訓練為主的教學模式，培養學生的創新思維能力、科學探究能力和實踐創新能力，充分調動學生學習的主動性、積極性和創造性，為今后自主開展科學研究工作打下堅實的基礎。本實驗利用數字化的實驗設備，通過簡單的方法或技術，在短時間內能夠獲得精確的實驗結果。在整個實驗及分析和整理數據的過程中，教師與學生形成互動，現場解決疑難問題，能夠節省課堂學時，更好地闡述實驗原理，提高課堂教學效率，是信息技術與生命科學實驗教學整合的新途徑。

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Application of chlorophyll fluorescence analysis technique in experimental teaching

BAN Yihui1, XU Zhouying2, LI Jing1, LI Yuan1, CHEN Bifeng1, LI Junli1, XIE Hao1

(1. School of Chemistry, Chemical Engineering and Life Sciences, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China; 2. School of Civil Engineering and Architecture, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China)

Plant photosynthesis is an important research content of plant physiology and related courses, and chlorophyll fluorescence analysis technology is an important technical means to quickly and accurately detect plant physiological status. In this paper, a comprehensive design experiment project was designed to study the effects of different temperature and water conditions on plant photosynthesis by chlorophyll fluorescence analysis technology, and to study the effect of different temperature and water stress on plant photosynthesis characteristics. The implementation of this experimental project can familiarize students with the working principle of the modulated chlorophyll fluorescence meter and grasp the chlorophyll fluorescence analysis technology, so as to improve students’ ability to independently carry out scientific research projects, as well as their innovative consciousness and innovative ability.

chlorophyll fluorescence analysis technique; photosynthesis; temperature stress; water stress

G642.0

A

1002-4956(2019)09-0172-04

2019-02-21

武漢理工大學教學改革研究項目（w2018113，w2019121，w2019084）

班宜輝（1985—），男，河南商丘，博士，助理研究員，主要研究方向為植物抗逆機制。

E-mail: banyihui@whut.edu.cn

徐舟影（1987—），女，安徽池州，博士，副教授，碩士生導師，主要研究方向為植物-微生物共生機制。

E-mail: zhouyingxu@126.com

10.16791/j.cnki.sjg.2019.09.044