平喘I號對支氣管哮喘小鼠氣道重塑中SDF-1及CXCR4表達的影響

李鵬飛 楊季國 吳慧芬 林之涵 岑嬋琳 閆姬雪

[摘要] 目的 研究平喘I號調(diào)節(jié)基質(zhì)細胞衍生因子-1（SDF-1）及其受體CXCR4在支氣管哮喘小鼠肺內(nèi)表達變化及影響。 方法 72只雌性BALB/C小鼠按數(shù)字隨機分為正常對照組、模型對照組、布地奈德組、平喘I號低劑量組、中劑量組、高劑量組，共6組，每組12只。通過卵清蛋白（OVA）致敏和激發(fā)復制支氣管小鼠哮喘模型，然后分別予生理鹽水、布地奈德藥物及中藥平喘I號低、中、高劑量干預。取小鼠肺組織，通過病理切片觀察，圖像分析軟件測定支氣管壁厚度（Wat）和平滑肌厚度（Wam），采用實時定量PCR測定小鼠肺組織中SDF-1 mRNA及CXCR4 mRNA的含量，通過免疫印跡法檢測肺組織中SDF-1及CXCR4的蛋白表達水平，采用線性相關分析技術測量了SDF-1與CXCR4的相關性。 結果 SDF-1及CXCR4的表達水平在正常對照組中較低，在模型對照組中表達水平明顯增高（P均<0.01）。與模型對照組比較，平喘I號各劑量組和布地奈德組中SDF-1及CXCR4的表達水平均明顯降低（P<0.01或P<0.05）;其中布地奈德組表達水平低于平喘I號低劑量和中劑量組（P<0.05或P<0.01），而中藥高劑量組的表達水平低于布地奈德組（P<0.05）。 結論 在支氣管哮喘氣道炎癥及其氣道重塑過程中，SDF-1及其受體CXCR4兩者相互作用，干預其重塑過程。平喘I號通過影響SDF-1及CXCR4在肺內(nèi)的表達而干預哮喘氣道重塑，達到緩解哮喘癥狀的作用。

[關鍵詞] 支氣管哮喘;氣道重塑;平喘I號;基質(zhì)細胞衍生因子-1;CXC趨化因子受體4

[中圖分類號] R562.25? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）21-0043-04

Effect of Pingchuan Ⅰ on the expression of SDF-1 and CXCR4 in airway remodeling in asthmatic mice

LI Pengfei? ?YANG Jiguo? ?WU Huifen? ?LIN Zhihan? CEN Chanlin? ?YAN Jixue

Department of Traditional Chinese Medicine Pediatrics， Hangzhou Xiaoshan District Hospital， Hangzhou? ?310053， China

[Abstract] Objective To study the influence of Pingchuan Ⅰ in regulating stromal cell-derived factor-1 （SDF-1） expression and its receptor CXCR4 in the lung of bronchial asthma mice. Methods 72 female BALB/C mice were randomly divided into normal control group， model control group， budesonide group， Pingchuan Ⅰ low-dose group， middle-dose group and high-dose group. There were 12 mice in each group. The bronchial mouse asthma model was copied by ovalbumin （OVA） sensitization and stimulation， and then administered with normal saline， budesonide and low， medium and high doses of Chinese medicine Pingchuan Ⅰ. Mouse lung tissues were taken and observed by pathological sections. Image analysis software was used to measure bronchial wall thickness （Wat） and smooth muscle thickness （Wam）. Real-time quantitative PCR was used to determine SDF-1 mRNA and CXCR4 mRNA in mouse lung tissues. The expression levels of SDF-1 and CXCR4 in lung tissue were detected by Western blotting. The correlation between SDF-1 and CXCR4 was measured by linear correlation analysis. Results The expression levels of SDF-1 and CXCR4 were low in the normal control group， and the expression levels in the model control group were significantly higher （P<0.01）. Compared with those of the model control group， the expression levels of SDF-1 and CXCR4 in the Pingchuan I each dose group and the budesonide group were significantly lower（P<0.01 or P<0.05）. The expression level in budesonide group was lower than that in the low-dose and medium-dose Pingchuan Ⅰ group （P<0.05 or P<0.01）. While the expression level of the high dose Chinese medicine group was lower than that of the budesonide group（P<0.05）. Conclusion In the process of airway inflammation and airway remodeling in bronchial asthma， SDF-1 and its receptor CXCR4 are involved in the remodeling process. Pingchuan Ⅰ interferes with airway remodeling in asthma by affecting the expression of SDF-1 and CXCR4 in the lungs， to relieve the symptoms of asthma.

[Key words] Bronchial asthma; Airway remodeling; Pingchuan Ⅰ; Stromal cell-derived factor-1; CXC chemokine receptor 4

支氣管哮喘（Asthma）簡稱哮喘，是由IgE介導的呼吸道變態(tài)反應性疾病，由多種炎癥細胞及細胞因子參與的慢性炎癥，通過反復發(fā)作與刺激，導致可逆性氣道阻塞性疾病，是兒科臨床中常見的呼吸道疾病。目前研究階段，哮喘病理特征是氣道高反應性和氣道重塑，其中具體發(fā)作機制并未完全闡明。現(xiàn)階段霧化藥物中吸入型的糖皮質(zhì)激素是作為控制及防治哮喘氣道重塑的首選藥物，但是低劑量的糖皮質(zhì)激素卻不能拮抗氣道重塑，同時患兒長期、大劑量的使用皮質(zhì)激素可引起不同程度的全身副作用。本實驗中使用的平喘I號湯劑是楊季國教授在臨床多年總結出的治療哮喘急性發(fā)作的方劑，該方劑經(jīng)過配伍在哮喘的急性發(fā)作中有較為明顯的效果。在趨化因子家族中的基質(zhì)細胞衍生因子-1（SDF-1）和CXC趨化因子受體4（CXCR4）兩者相互作用，可能通過影響氣道炎癥及氣道血管生成參與了支氣管哮喘及氣道重塑。本實驗通過觀察小鼠哮喘模型肺組織中SDF-1 及CXCR4表達的變化，進一步深入明確哮喘發(fā)作機制。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選擇由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗室中心提供的BALB/C雌性小鼠72只，4～6周齡，體重（14±2）g。卵清蛋白（OVA）（型號：A5503）：由美國Sigma公司提供;小鼠單克隆SDF-1抗體（產(chǎn)品編號：sc-74271）和小鼠單克隆CXCR4抗體（產(chǎn)品編號：sc-53534）：購于美國Santa cruz 公司。吸入用布地奈德混懸液：購于阿斯利康公司;RNA抽提試劑（TRIzol）：購于美國Invitrogen公司;病理圖像分析儀（DMR+Q550）：購于德國LEICA公司。

1.2 方法

1.2.1 致敏液和激發(fā)液? 致敏液配置：在清潔小燒杯中加入0.15 mL的生理鹽水，同時加入40 μgOVA，充分攪拌混合，然后取4%氫氧化鋁凝膠溶液2 mg（0.05 mL）與上述混合液體攪拌混合，充分攪拌30 min，從而得到0.2 mL的OVA-氫氧化鋁混懸液。激發(fā)液：1%OVA霧化液，由OVA與生理鹽水成比例混合攪拌溶解，制成含有1%OVA霧化液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 平喘I號中藥復方的制備? 湯劑平喘Ⅰ號是由炒黃芩10 g、竹瀝半夏10 g、旋復花10 g、葶藶子10 g、代赭石20 g、蘇子10 g、白芥子10 g、杠板歸10 g、地龍10 g組成，顆粒劑由藥房配置，加水直接攪拌溶解。

1.2.3 動物分組及其模型制作方法? 所有小鼠隨機分為6組，分別為平喘Ⅰ號低、中、高劑量組、正常對照組、模型對照組、布地奈德對照組，每組12只。根據(jù)文獻[1-2]，除正常對照組外，其余5組小鼠分別在實驗時間第1天、第8天、第15天用注射器在小鼠腹腔注射OVA-氫氧化鋁混懸液0.2 mL致敏液，正常對照組注射同等劑量的生理鹽水為對照。從第20天開始，正常對照組吸入生理鹽水，其他組吸入1%OVA霧化液，隔天1次，每次40 min，共6周。

給藥方法：每次霧化前30 min，中藥組分別以10 g/（kg·d）、50 g/（kg·d）、100 g/（kg·d）的濃度予低、中、高劑量組灌胃，西藥組霧化吸入布地奈德霧化液，正常對照組及模型對照組予生理鹽水灌胃。各組小鼠末次激發(fā)24 h內(nèi)腹腔注射戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉后處死，在小鼠胸腔部位切開取出右肺葉，同時將肺葉由10%中性甲醛固定，按照常規(guī)脫水，采用石蠟包埋，最后進行HE染色，所得到的切片用于病理學組織觀察。同時將剩余的肺葉放入液氮凍存以備后續(xù)檢查。

1.2.4 HE染色? 小鼠肺組織石蠟切片，常規(guī)脫水，然后蘇木精伊紅染色，脫水封片。參考文獻[2]關于氣道各層的定義，采用圖像分析軟件，對肺內(nèi)支氣管基底膜周徑（Pbm）、肺內(nèi)支氣管總的面積（Wat1）、支氣管管腔內(nèi)面積（Wat2）、平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣管面積（Wam2）、平滑肌外緣內(nèi)氣管面積（Wam1）進行測量后，分別以（Wam1- Wam2）/Pbm和（Wat1-Wat2）/Pbm來表示W(wǎng)am和Wat。

1.2.5 RT-PCR? 將存儲于液氮中的肺組織提取100 mg，提取RNA，實驗采用TRIzo法，并將其反轉錄成cDNA。小鼠SDF-1引物：上游5-ACCCTTGGTCTCAA-CATTCC-3，下游5-GCCTTGCCCTCTATCCTTCT-3，擴增長度為183 bp;CXCR4引物：上游5-GGCA-ATGGGTTGGTAATC-3，下游5-GACAATGGCAA-GGTAGCG-3，擴增長度為187 bp;內(nèi)參β-actin，上游 5-TCCGGTGTTAGGATATGACT-3，下游 5-TGTGCCTGCAACAGGAGTCGG-3擴增的長度為283 bp。記錄其反應過程：在實時定量PCR儀上，按操作進行實時定量PCR。最終記錄數(shù)據(jù)并分析的軟件采用ABI Prism 7000 SDS軟件。Real-time PCR檢測的各組目的基因相對于內(nèi)參β-actin的擴增效率，采用2^-△△Ct法，△△Ct=△Ct-△Ct（average）。

1.2.6 Western Blot檢測SDF-1和CXCR4的表達? 在冰浴條件下從組織標本中提取細胞總蛋白，并調(diào)整蛋白濃度及測定蛋白質(zhì)含量。一抗：小鼠單克隆SDF-1和CXCR4抗體，稀釋度為1：2000，將蛋白樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳、轉膜及封閉。然后用辣根過氧化物酶（HRP）標記過的二抗孵育洗滌、曝光、顯影、定影。最后使用其分析軟件，分析SDF-1和CXCR4光密度值，以β-actin為內(nèi)參，標準化SDF-1和CXCR4的光密度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗完成后數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，行方差齊性檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。兩組之間樣本均數(shù)互相比較采用LSD檢驗，如果方差不齊者用Dunnett，T3檢驗，兩個變量的相關分析采用直線相關法。

2 結果

2.1 病理組織學改變

實驗中觀察正常對照組，可以看到小鼠肺組織支氣管壁結構較為完整，無炎癥反應及細胞浸潤等改變（封三圖6）。相比較之下，在高倍鏡中對模型對照組觀察中發(fā)現(xiàn)，小鼠支氣管黏膜上皮細胞大片壞死，部分上皮呈乳頭狀增生，并伴有管壁周圍炎性細胞浸潤，氣道壁及平滑肌層明顯增厚，管腔狹窄（封三圖7）。西藥布地奈德霧化治療組炎癥反應明顯減輕，炎癥細胞浸潤減少，氣道黏膜相對較為完整（封三圖8），其中平喘I號高劑量組在支氣管上皮及炎性細胞浸潤方面較布地奈德組改善更為明顯（封三圖9）。

2.2 實驗各組Wat與Wam的比較

各中藥組和布地奈德組較正常對照組可見明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），各治療組較模型對照組降低（P<0.01或P<0.05），其中中藥高劑量組明顯低于布地奈德組（P<0.05）。見表1。

2.3 各組小鼠RT-PCR結果

實驗結果表明，SDF-1與CXCR4的表達相較正常對照組，在模型對照組中明顯增多（P<0.01）。經(jīng)過中藥治療組和布地奈德組治療后的表達顯著降低（P<0.01或P<0.05），其中布地奈德組與平喘I號的高劑量組相比較效果明顯（P<0.05）。見表2。

2.4 各組小鼠SDF-1和CXCR4蛋白的表達

Western Blot 結果提示，模型對照組相比正常對照組可見明顯的蛋白表達（P<0.01），各治療組相對于模型對照組明顯降低（P<0.01），其中平喘I號高劑量組的表達低于布地奈德治療組（P<0.05）。見表3。

2.5 相關性分析

小鼠肺組織中SDF-1蛋白的表達與Wat呈正相關性，其相關系數(shù)（r=0.843，P<0.05），小鼠CXCR4蛋白的表達與Wat呈正相關性，其相關系數(shù)（r=0.791，P<0.05），在SDF-1mRNA的表達量和SDF-1蛋白水平的表達相關性分析顯示，兩者呈正相關（r=0.896，P<0.05）。

3 討論

支氣管哮喘是由多種細胞因子、各種炎癥細胞參與的一種氣道變態(tài)反應性疾病[3]，支氣管哮喘的主要特征是氣道重塑[4]，其發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)[5]就是氣道高反應性和氣流受限。近年研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1/CXCR4[6]在支氣管哮喘氣道炎癥及氣道高反應性中起著重要作用。本實驗通過建立支氣管哮喘小鼠的氣道模型[7]，更進一步觀察SDF-1/CXCR4在支氣管哮喘氣道重塑[8]中的作用。

本實驗的小鼠通過腹腔注射OVA-氫氧化鋁的混合液致敏，然后霧化吸入OVA激發(fā)小鼠后，小鼠出現(xiàn)呼吸急促、鼻翼煽動、煩躁不安等癥狀，通過測量模型對照組中支氣管壁厚度和平滑肌厚度的變化，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，從而得知哮喘小鼠模型是成功的。

基質(zhì)細胞衍生因子（SDF-1）[9]，又被稱作CXCL12，屬于CXC趨化因子家族，在哮喘的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用[10]。在目前已知的T淋巴細胞趨化物質(zhì)中，SDF-1是最強的一種，主要作用部位在單核細胞、T細胞和CD34+骨髓前體細胞，對單核細胞、嗜酸性粒細胞等均有很強的趨化作用，同時能增強上皮細胞的吞噬功能[11]，因此SDF-1在支氣管氣道炎癥中通過對T細胞的趨化作用參與其中。在支氣管哮喘氣道重塑過程中，嗜酸性粒細胞在其中發(fā)揮重要作用，而SDF-1又介導了嗜酸性粒細胞的趨化作用，可以看出在哮喘的起始免疫應答過程中，SDF-1起到非常關鍵的作用。同時參考文獻Hoshino M[12]的研究發(fā)現(xiàn)，在支氣管哮喘患者中氣道黏膜下血管增多，而肺組織中SDF-1陽性細胞的表達數(shù)明顯增加，說明兩者的發(fā)生呈正相關，且其細胞數(shù)的增加與支氣管氣道口徑呈負相關。從而得知，SDF-1的變化在支氣管氣道重塑及其氣道炎癥中發(fā)揮著重要作用。

CXC趨化因子受體4（CXCR4）是SDF-1的特異性受體，由352個氨基酸組成，是7次跨膜[13]表達于不同類型細胞上的蛋白受體，主要表達于各種造血細胞、大部分T淋巴細胞、所有的B淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞，同時在人體的大部分組織中有構成性表達[14]。CXCR4是SDF-1的唯一受體[15]，同時SDF-1也是CXCR4的唯一配體[16]，兩者具有高度的親和力，相互作用，在組織與組織、細胞與細胞之間通過SDF-1/CXCR4軸[17]進行信息傳遞，從而對氣道的慢性炎癥反應起著至關重要的作用，進一步參與了機體的各種病理生理過程[18]，對于我們從支氣管氣道炎癥和氣道重塑方向研究支氣管哮喘提供了重要證據(jù)。

在目前的研究中，霧化吸入性的糖皮質(zhì)激素對于支氣管哮喘的治療以及緩解患兒的生活質(zhì)量有較為顯著的作用，本次研究中，布地奈德組抗炎作用強，對于支氣管壁厚度[19]及其黏膜的水腫緩解方面有著顯著效果，但我們在實際工作中會碰到家長對使用激素的擔心，同時長時間使用糖皮質(zhì)激素也會帶來一些全身性不良反應。目前中醫(yī)中藥給我們研究哮喘提供了新的方向。

平喘I號是通過長期在臨床經(jīng)驗中總結出的一組對小兒哮喘有明確療效的方劑。本研究中服用平喘I號方劑與霧化吸入布地奈德比較，其SDF-1及CXCR4的蛋白[20]和mRNA的表達較哮喘模型組均有下降，同時平喘I號高劑量組在控制氣道炎癥和緩解氣道重塑方面優(yōu)于布地奈德組，其機制可能與降低SDF-1及CXCR4的表達有關。因此我們應在本次研究基礎上進一步深化，為中醫(yī)中藥治療哮喘提供更多的科學依據(jù)。

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