不同采收期鐵皮石斛主要成分含量測定及比較

吳經耀　馮瑛

【摘 要】 目的：測定并比較不同采收期兩年生長期的鐵皮石斛中多糖含量、甘露糖含量、甘露糖與葡萄糖峰面積比及乙醇浸出物含量，尋找鐵皮石斛的最佳采收期。方法：

用紫外分光光度法進行多糖含量測定，高效液相法測定甘露糖、甘露糖與葡萄糖面積比，熱浸法測定乙醇浸出物。結果：按照干燥品計，頭年10月、次年3月采收的鐵皮石斛中多糖含量（%）分別為（31.6±2.8）、（38.3±2.7），兩組之間比較差異有統計學意義（P<0.05）;甘露糖含量（%）分別為（32.3±3.6）、（35.0±3.5），兩組之間比較差異無統計學意義（P>0.05）;甘露糖與葡萄糖峰面積比為（3.2±0.7）、（2.0±0.6），兩組之間比較差異有統計學意義（P<0.05）;乙醇浸出物含量（%）分別為（12.6±1.8）、（6.4±1.7），兩組之間比較差異有統計學意義（P<0.05）;鐵皮石斛多糖含量增加，甘露糖與葡萄糖峰面積比呈現遞減趨勢，乙醇浸出物含量呈現遞減趨勢。結論：鐵皮石斛頭年10月到翌年3月多糖含量最高，為最佳采收期。如中藥生產上需要以鐵皮石斛多糖為主要有效成分，兩年生的鐵皮石斛藥材采收時間為次年3月更科學合理。

【關鍵詞】 鐵皮石斛;多糖;甘露糖;甘露糖與葡萄糖峰面積比;乙醇浸出物

【中圖分類號】R282.6 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）10-0039-04

The Determination and Comparison of Main Components of Dendrobium officinale in Different Harvesting Periods

WU Jingyao FENG Ying

Institute of Traditional Chinese Medicine of Zhejiang province Co.Limited，Hangzhou 310023，China

Abstract：Objective To determine and compare the content of polysaccharide， mannose， peak area ratio of mannose and glucose and the content of ethanol extract in dendrobium candidum with different harvesting periods，to search for the best harvest period of dendrobium officinale.Methods The content of polysaccharide was determined by uv spectrophotometry， the area ratio of mannose， mannose and glucose was determined by HPLC， and the ethanol extract was determined by hot dip method. Results The polysaccharide content （%） of dendrobium officinalis collected in October of the first year and March of the next year were （31.6±2.8 ） and （38.3±2.7 ）， respectively. The mannose content （%） was （32.3±3.6 ） and （35.0±3.5 ）， respectively. There was no significant difference between the two groups. The peak area ratio of mannose to glucose was （3.2±0.7 ），? （2.0±0.6 ）， and there was a significant difference between the two groups. The content of ethanol extract （%） was （12.6±1.8 ） and （6.4±1.7 ）， respectively. The content of polysaccharide in dendrobium officinale increased， the peak area ratio of mannose and glucose decreased， and the content of ethanol extract decreased. Conclusion The content of polysaccharide in dendrobium officinale was the highest from October of the first year to March of the next year. If the polysaccharide of dendrobium candidum is the main active ingredient in the production of traditional Chinese medicine， the harvest time of the biennial dendrobium candidum in the following March should be more scientific and reasonable.

Key words： Dendrobium officinale; Polysaccharides; Mannose; The Ratio of the Sugar to the Glucose Peak; Ethanol Extract

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為石斛之極品，因其表皮呈鐵綠色而得名。鐵皮石斛具有獨特的藥用價值，被譽為“九大仙草”之首，《神農本草經》曰“主傷中、除痹、下氣、補五臟虛勞羸瘦、強陰、久服厚腸胃”，現代研究表明鐵皮石斛的莖能夠益胃生津，滋陰清熱，對治療口干煩躁、食少干嘔、陰虛火旺有很好的療效。文獻報道[1]對鐵皮石斛藥材的質量標準及最佳采收期進行研究，但其以總水溶性糖及總水溶性多糖含量為分析指標，發現11～3月期間含量較高，開花期4～5月明顯下降，隨后又開始回升，并且未參照最新版《中國藥典》進一步對頭年11月份到次年3月份的差異開展研究，故本實驗在2015版《中華人民共和國藥典》指導下，測定了浙江某種植基地頭年11月份到次年3月份不同采收時間兩年生鐵皮石斛中的多糖含量、甘露糖含量、甘露糖與葡萄糖峰面積比及乙醇浸出物含量，從而為鐵皮石斛最佳采收期和藥材質量控制提供了一定的參考依據。

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑 鐵皮石斛樣品采自浙江某種植基地，取自生長期為兩年的鐵皮石斛的干燥莖，經過浙江省中藥研究所教授級高工王志安鑒定為鐵皮石斛藥材，樣品干燥粉碎過三號篩。采收期分別為：浙1號到浙6號（2014年10月），浙7號到浙12號（2014年12月），浙13號到浙18號（2015年3月），浙19號到浙24號（2015年5月），浙25號到浙30號（2015年7月）。D-無水葡萄糖標準品（批號：110833-201205，中國食品藥品檢研究院，含量99.5%）。5%苯酚溶液：稱取苯酚（分析純，批號：20141108，蘭溪市六洞山化工試劑廠）2.5g，加純水50mL，搖勻即得（臨用配制）。硫酸（分析純，批號：20141108，杭州雙林化工試劑廠），95%乙醇（批號：20150104，杭州化學試劑有限公司）。

1.2 儀器 Lambda 20紫外/可見分光光度計（美國PERKIN ELMER公司），METTLER TOLEDOAB204-S電子天平（瑞士METTLER公司），TC-15套式恒溫鍋（浙江海寧新華醫療器械廠），Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent 20RBAX SB-C18色譜柱。

2 方法

2.1 多糖含量測定

2.1.1 供試品溶液的制備 取本品粉末約0.3g，加水200mL，加熱回流2h，放冷，轉移至250mL量瓶中，用少量水分次洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液2mL，置15mL離心管中，精密加入無水乙醇10mL，搖勻，冷藏1h，取出，離心（轉速為每分鐘4000轉）30min，棄去上清液（必要時濾過），沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉移至25mL量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 標準曲線制備 精密量取對照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分別置10mL具塞試管中，各加水補至1.0mL，精密加入5%苯酚溶液1mL（臨用配制），搖勻，再精密加硫酸5mL，搖勻，置沸水浴中加熱20min，取出，置冰浴中冷卻5min，以相應試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在488nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.1.3 測定法 精密量取供試品溶液1mL，置10mL具塞試管中，照標準曲線制備項下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1mL起，依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的量，計算，即得[1]。

2.2 甘露糖含量測定

2.2.1 甘露糖色譜條件與系統適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-0.02mol/L乙酸銨溶液（20∶80）為流動相;檢測波長為250nm。理論板數按甘露糖峰計算應不低于4000。

2.2.2 校正因子測定 取鹽酸氨基葡萄糖適量，精密稱定，加水制成每1mL含12mg的溶液，作為內標溶液。另取甘露糖對照品約10mg，精密稱定，置100mL量瓶中，精密加入內標溶液1mL，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，吸取400μL，加0.5mol/L的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液與0.3mol/L氫氧化鈉溶液各400μL，混勻，70℃水浴反應100min。再加0.3mol/L的鹽酸溶液500μL，混勻，用三氯甲烷洗滌3次，每次2mL，棄去三氯甲烷液，水層離心后，取上清液10μL，注入液相色譜儀，測定，計算校正因子。

2.2.3 測定法 取本品粉末（過三號篩）約0.12g，精密稱定，置索氏提取器中，加80%乙醇適量，加熱回流提取4h，棄去乙醇液，藥渣揮干乙醇，濾紙筒拆開置于燒杯中，加水100mL，再精密加入內標溶液2mL，煎煮1h并時時攪拌，放冷，加水補至約100mL，混勻，離心，吸取上清液1mL，置頂空瓶中，加3.0mol/L的鹽酸溶液0.5mL，封口，混勻，110℃水解1h，放冷，用3.0mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值至中性，吸取400μL，照校正因子測定法，自“加0.5mol/L的PMP甲醇溶液”起，依法操作，取上清液10μL，注入液相色譜儀，測定，即得[1]。

2.3 甘露糖與葡萄糖峰面積比 取葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成每1mL含50μg的溶液，作為對照品溶液。精密吸取0.4mL，按照2015版《中國藥典》一部鐵皮石斛項下含量測定甘露糖項下方法依法測定。

2.4 浸出物 按照2015版《中國藥典》通則2201的熱浸法測定，用乙醇作溶劑。2.1～2.4結果見表1和表2。

2.5 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為差異具有高度統計學意義。

3 結果

3.1 不同采收期鐵皮石斛莖的主要成分含量 見表1。

2.2 不同采收期鐵皮石斛莖主要成分含量的統計學處理結果見表2。

4 討論

根據2015版《中國藥典》一部[2]：供試品溶液的制備流程其中一部分為“（轉速為每分鐘4000轉）離心20min，棄去上清液（必要時濾過）”，此處值得商榷。因為離心后容易出現白色沉淀，有一部分粘附離心管壁上，還有少量很淡的白色沉淀在上清液里，傾倒上清液時容易損失，造成多糖含量偏低，如果改為“（轉速為每分鐘4000轉）離心30min，上清液濾過，用少量熱水洗滌濾紙數次，合并濾液”，這樣較為妥當。原因是離心時間延長，可以把白色沉淀最大限度附著在離心管壁上，過濾可以保證很淡的白色沉淀得以留在濾紙上，最大限度減少不同采收時間多糖含量的差異。

比較表1和表2中采收期（2014.10與2015.3）的鐵皮石斛，多糖含量增加，乙醇浸出物含量呈現遞減趨勢。一般情況乙醇浸出物是指用95%的乙醇采用熱浸法提取制得。高濃度的乙醇提取出的成分主要是脂溶性成分為主，而多糖易溶于熱水屬于水溶性成分。藥材多糖含量增加，意味著脂溶性成分占比下降，所以乙醇浸出物含量呈現遞減趨勢。藥材多糖含量增加，甘露糖與葡萄糖峰面積比呈現遞減趨勢可能原因是多糖含量增加，葡萄糖峰面積呈現出上升趨勢，甘露糖與葡萄糖峰面積比中的分母增加，所以兩者的面積比呈現下降趨勢。根據實驗結果，鐵皮石斛頭年10月到翌年3月多糖含量最高，這段時間為最佳采收期。此外鐵皮石斛（2015.3采收）比鐵皮石斛（2014.10采收）多糖含量高，從另一方面證實了本文結論如果中藥生產過程中，以鐵皮石斛多糖為主要有效成分，次年3月采收鐵皮石斛比頭年10月采收要更科學合理，符合石斛生長過程中多糖含量變化的規律[3-15]。鐵皮石斛每年4～5月份為開花期，多糖含量明顯下降后又開始回升，最佳生長期和最佳采收期基本符合。本研究可以為企業的石斛種植和采收提供了可靠的科學依據。

參考文獻

[1]林燕飛. 鐵皮石斛藥材的質量標準及最佳采收期的研究[D].杭州：浙江大學， 2009.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫藥科技出版社， 2015：282-283.

[3]林燕飛， 曾蘇， 林小香， 等.鐵皮石斛水溶性多糖含量的動態研究[J].現代中藥研究與實踐， 2009， 23（2）：19-21.

[4]鄭柏勤，朱惠洪.比色法測定鐵皮石斛藥材中多糖的含量[J].農業與技術，2015，35（22）：14-15.

[5]唐麗，李菁，龍華，等.不同生長齡鐵皮石斛莖與葉中總多糖、總生物堿及總黃酮含量的差異[J].廣東農業科學，2015（8）：17-20.

[6]魏歡平，李翠，羅罡，等.鐵皮石斛不同階段多糖和甘露糖含量研究[J].安徽農業通報，2014，20（20）：29-31.

[7]葉煒.鐵皮石斛多糖累積規律研究進展[J].亞熱帶植物科學，2013，42（4）：367-372.

[8]肖穎.鐵皮石斛多糖提取工藝的研究[J].信陽農林學院學報，2014，24（1）：121-123.

[9]黃曉君，聶少平，王玉婷，等.鐵皮石斛多糖提取工藝優化極其成分分析[J].食品科學，2013，34（22）：21-26.

[10]呂佳妮，陳素紅，徐娟華.鐵皮石斛根中石斛多糖的響應面法提取優化研究[J].浙江中醫雜志，2014，6（49）：459-461.

[11]趙鋒，李娟，何云芳，等.鐵皮石斛莖干含水率及多糖含量研究[J].浙江林業科技，2013，33（4）：6-8.

[12]葛穎華，王杰，周萃，等.鐵皮石斛中石斛堿、多糖的含量測定[J].中國中醫藥科技，2015，22（5）：527-532.

[13]王培培，魯芹飛，陳建南，等.正交實驗法優化鐵皮石斛多糖的提取工藝[J].時珍國醫國藥，2012，23（11）：2781-2782.

[14]盛家榮，李志華，易艷波，等. 鐵皮石斛多糖的研究進展[J].廣西科學院學報，2011，27（4）：338-340.

[15]李玲，鄧曉蘭，趙興兵，等.鐵皮石斛化學成分及藥理作用研究進展[J].腫瘤藥學，2011，1（2）：90-94.