血清miR-21、miR-218與MMP-2對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤診斷與預(yù)后評(píng)估的價(jià)值

趙 娟，王曉蓉

(上海電力醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海長(zhǎng)寧 200050)

滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤惡性程度高，多繼發(fā)于葡萄胎、侵蝕性葡萄胎、流產(chǎn)或足月分娩后。早期患者癥狀不典型，隨瘤體增大而表現(xiàn)為不規(guī)則陰道流血，子宮變得大而軟等癥狀[1]。目前，滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的篩查手段主要包括血清β-人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)檢測(cè)和超聲。然而，血清β-HCG缺乏特異性，其水平在多種生理、病理狀態(tài)下均會(huì)增高[2]；有報(bào)道指出B超對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的診斷率僅為67.4%[3]。有學(xué)者在人滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系JEG-3中發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miR)-21和miR-218是參與調(diào)控JEG-3惡性生物學(xué)行為的兩個(gè)重要短鏈非編碼RNA[4-5]。然而，關(guān)于兩者的臨床應(yīng)用相關(guān)研究仍然缺乏。基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)是一類重要的水解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，參與到腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移過程。李靜等[6]指出，MMP-2的表達(dá)下調(diào)可顯著抑制JEG-3細(xì)胞的侵襲與增殖，與健康人群比較，MMP-2在滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者中可能存在差異表達(dá)。本研究旨在探討滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者血清miR-21、miR-218聯(lián)合MMP-2的診斷及預(yù)后價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將本院2012年1月至2015年5月確診的滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者80例納入研究作為滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組，均為首次住院且經(jīng)內(nèi)鏡組織學(xué)檢查確診的患者。滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的診斷和分期依據(jù)婦產(chǎn)科學(xué)(第9版)[7]。其中Ⅰ～Ⅱ期患者47例，Ⅲ～Ⅳ期患者33例；發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移24例(肺轉(zhuǎn)移13例、腦轉(zhuǎn)移2例、肝脾轉(zhuǎn)移9例)，未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移56例。另外，將同期的本院子宮內(nèi)膜炎患者80例納入研究作為子宮內(nèi)膜炎組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。兩組間在年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙史及飲酒史方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者血清β-HCG水平顯著高于子宮內(nèi)膜炎患者(P<0.05)，見表1。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 使用含有促凝劑的采血管采集滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者和子宮內(nèi)膜炎患者接受治療前的靜脈血5 mL，于1 h內(nèi)在4 ℃條件下以12 000×g離心15 min(離心半徑10 cm)，收集上層血清，并放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z測(cè)。

表1 兩組間臨床資料比較

1.2.2血清miR-21、miR-218、MMP-2和β-HCG水平的檢測(cè) 使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)進(jìn)行基因的相對(duì)定量。miR-21、miR-218與U6引物序列見表2，采用2-ΔCt法計(jì)算miRs的相對(duì)表達(dá)量,然后取負(fù)對(duì)數(shù)處理后得檢測(cè)值。血清miR-21、miR-218和U6的熔解曲線峰型單一，說明沒有非特異性擴(kuò)增，見圖1。血清MMP-2的檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，步驟如下：標(biāo)本(MMP-2濃度為5、10、25、50、100 pg/mL的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，陽性和陰性對(duì)照)加入微孔板中與抗體室溫孵育40 min，洗板5次，在避光條件下加入酶標(biāo)記的單抗室溫孵育40 min，再洗板5次，加入底物反應(yīng)15 min后終止反應(yīng)，于DNM-9606酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)上檢測(cè)吸光度(A)值。MMP-2檢測(cè)試劑盒由上海超研生物科技有限公司提供。血清β-HCG的檢測(cè)采用化學(xué)發(fā)光法，檢測(cè)儀器為日本Olympus公司AU5400型全自動(dòng)生化分析儀。

1.3隨訪 對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者進(jìn)行40個(gè)月電話隨訪，并記錄患者的生存時(shí)間。隨訪終點(diǎn)為以下三種情況之一：(1)40個(gè)月內(nèi)患者死亡；(2)40個(gè)月內(nèi)患者退出該項(xiàng)研究；(3)40個(gè)月隨訪結(jié)束。

注：A為miR-21；B為miR-218；C為U6

表2 miR-21、miR-218與U6的引物序列

2 結(jié)果

2.1兩組間血清miR-21、miR-218和MMP-2水平的比較 滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤組血清miR-21和MMP-2水平顯著高于子宮內(nèi)膜炎組(P<0.05)，而血清miR-218水平顯著低于子宮內(nèi)膜炎組(P<0.05)，見表3。

表3 兩組間血清miR-21、miR-218和MMP-2水平的比較

2.2血清miR-21、miR-218、MMP-2水平與滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤臨床特征的關(guān)系 血清miR-21、miR-218和MMP-2水平與滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者年齡、吸煙史、飲酒史和BMI等均無明顯關(guān)系(P>0.05)。此外，血清miR-21、miR-218和MMP-2水平與TNM分期Ⅲ～Ⅳ期(miR-21：r=0.514，P=0.004；miR-218：r=-0.465，P=0.009；MMP-2：r=0.508，P=0.003)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(miR-21：r=0.501，P=0.005；miR-218：r=-0.449，P=0.013；MMP-2：r=0.499，P=0.010)相關(guān)，而β-HCG水平與滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤臨床特征均無明顯關(guān)系(P>0.05)。

表4 血清miR-21、miR-218和MMP-2與滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤臨床特征的關(guān)系

續(xù)表4 血清miR-21、miR-218和MMP-2與滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤臨床特征的關(guān)系

2.3血清miR-21、miR-218、MMP-2和β-HCG對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤鑒別的價(jià)值 血清miR-21、miR-218、MMP-2和β-HCG對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的診斷界值分別為17.6、58.0、25.5 pg/mL和16.4 mIU/mL，見圖2、表5。

圖2 血清miR-21、miR-218、MMP-2和β-HCG用于滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤鑒別診斷的ROC曲線

表5 血清miR-21、miR-218、MMP-2、β-HCG用于滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤鑒別診斷的價(jià)值

2.4血清miR-21、miR-218、MMP-2、β-HCG水平與滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤預(yù)后和Cox分析 經(jīng)40個(gè)月隨訪，共22例滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者死亡。80例滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者分別依據(jù)miR-21、miR-218和MMP-2的中位數(shù)分為高miR-21與低miR-21組、高miR-218與低miR-218組及高M(jìn)MP-2與低MMP-2組。相較于低miR-21組、高miR-218組、低MMP-2組和低β-HCG組，高miR-21組(χ2=8.711，P<0.05，圖3-A)、低miR-218組(χ2=12.616，P<0.05，圖3-B)、高M(jìn)MP-2組(χ2=5.396，P<0.05，圖3-C)和高β-HCG組(χ2=3.877，P<0.05，圖3-D)生存率均顯著降低。Cox分析結(jié)果提示，血清高水平miR-21、低水平miR-218、高水平MMP-2和高水平β-HCG是提高患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的重要因素(P<0.05)；而年齡、BMI、吸煙、飲酒等因素不能顯著提高患者死亡風(fēng)險(xiǎn)，見表6。

圖3 血清miR-21、miR-218、MMP-2、β-HCG水平與預(yù)后的關(guān)系

表6 Cox回歸模型分析

3 討論

目前，滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤診斷金標(biāo)準(zhǔn)為病理學(xué)檢查。β-HCG是滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤輔助診斷非常重要的參考指標(biāo)，但多種病理、生理狀態(tài)下β-HCG均可出現(xiàn)水平升高[8-9]。值得注意的是，本次研究也發(fā)現(xiàn)β-HCG用于鑒別絨毛膜癌與子宮內(nèi)膜炎的特異度不高，僅為59.3%，這與之前β-HCG缺乏特異性的報(bào)道相一致[10-11]，再一次證實(shí)血清β-HCG在鑒別診斷滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤時(shí)仍具有特異性較低的不足。

miR-21、miR-218是近年研究發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)重要的癌癥相關(guān)miR。WANG等[4]通過qPCR檢測(cè)體外培養(yǎng)人滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系JEG-3發(fā)現(xiàn)，與健康人滋養(yǎng)層細(xì)胞相比JEG-3細(xì)胞中miR-21表達(dá)顯著增高，而JEG-3經(jīng)過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染上調(diào)細(xì)胞miR-21表達(dá)水平后，觀察到JEG-3細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力均顯著提高。SHI等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA MALAT1可通過“海綿作用”吸附并抑制miR-218，從而促進(jìn)JEG-3細(xì)胞的增殖。然而，上述研究均停留在基礎(chǔ)研究，關(guān)于miR-21和miR-218在滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值評(píng)估未見報(bào)道。本次研究發(fā)現(xiàn)，與子宮內(nèi)膜炎相比，滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者血清miR-21水平顯著增高，而miR-218水平顯著降低，且兩者水平與TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期及發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，這些臨床研究結(jié)果與前期基礎(chǔ)研究結(jié)果相符[4-5]。

既往的研究顯示，滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤JEG-3細(xì)胞系中MMP-2基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，并且MMP-2的上調(diào)參與了滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[12]。本次研究首次通過臨床樣本檢測(cè)到了滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤患者血清中MMP-2的差異表達(dá)，且血清MMP-2水平在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期及發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者中的升高最為顯著，與前期的細(xì)胞學(xué)研究相符[12]。

血清miR-21、miR-218和MMP-2用于鑒別診斷滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤與子宮內(nèi)膜炎的靈敏度/特異度分別為91.2%/83.7%、68.5%/79.9%和76.2%/84.3%；而聯(lián)合檢測(cè)miR-21、miR-218、MMP-2與β-HCG后，特異度顯著提高，達(dá)到98.4%，提示聯(lián)合血清miR-21、miR-218和MMP-2具有較高的診斷價(jià)值。多個(gè)國(guó)內(nèi)外臨床研究均提示，聯(lián)合多個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)有助于提高惡性腫瘤的檢出率[13-15]，本研究也進(jìn)一步證實(shí)了前期的發(fā)現(xiàn)。Cox分析結(jié)果提示，血清高水平miR-21、低水平miR-218、高水平MMP-2和高水平β-HCG是提高患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的重要因素；而年齡、BMI、吸煙、飲酒等因素不能顯著提高患者死亡風(fēng)險(xiǎn)，證實(shí)了血清miR-21、miR-218和MMP-2水平可作為滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的診斷和疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)。生存分析結(jié)果提示，高miR-21組、低miR-218組、高M(jìn)MP-2組、高β-HCG組患者的預(yù)后更差，這與前期多個(gè)基礎(chǔ)研究結(jié)果相符[5-6,10]。

4 結(jié)論

綜上所述，本次研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合miR-21、miR-218和MMP-2檢測(cè)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤的診斷具有潛在價(jià)值，并發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-218和MMP-2在滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和預(yù)后評(píng)價(jià)中有重要意義。