TNF-α、CD40基因多態性與乙肝肝硬化的相關性研究

吳應冬，周寶勤，謝 群，周安琪

(海安市人民醫院感染科,江蘇海安 226600 )

乙型病毒性肝炎(乙肝)作為我國最常見的傳染病，在慢性乙肝的進展中，隨著肝小葉結構的破壞及肝纖維化的形成，最終會導致肝硬化的發生[1-2]。既往研究發現HBV感染過程中，腫瘤壞死因子α(TNF-α)可以通過核因子-B細胞κ鏈(NF-κB)使細胞毒性T淋巴細胞激活，抑制甚至清除乙肝病毒；其次，TNF-α的水平與乙肝的病情程度及臨床類型也密切相關[3-4]。TNF-α基因長約2 676 bp，因為在細胞中不存在，在刺激時它是由細胞合成的。因此，SNP基因啟動子區具有重要意義。目前，TNF-α基因多態性多見于不同位點比如308位點、238位點等。啟動子308多態性與慢性乙型肝炎、肝硬化患者、肝癌患者等密切相關[5]。亦有研究證實肝硬化與CD40-CD40L信號轉導途徑相關[6]。此次研究中檢測TNF-α、CD40基因多態性與乙肝肝硬化的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年12月至2017年12月本院收治的150例經過肝硬化患者作為觀察組。肝硬化診斷標準參考“病毒性肝炎防治方案”[7]。另外選取同期150例體檢健康者作為對照組，兩組患者的年齡、性別差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

1.2方法

1.2.1標本采集 分別抽取觀察組及對照組的全血1 mL，用EDTA抗凝。4 ℃，3 000 r/min離心5 min，分離上清，收集細胞沉淀用于基因組DNA檢測。

表1 兩組患者的一般資料比較

1.2.2基因型鑒定 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)結合測序。(1)PCR擴增：包括308位點的TNF-α、sl883832位點及rs48 10485位點的CD40。聚合酶鏈反應總體積為20 μL，基因組DNA為2 μL,下游引物1 μL(序列見表2)，Taq酶1 U，10×PCR緩沖液2 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，25 mmol/L dNTPs 2 μL，去離子水9.8 μL。程序設定：先94 ℃ 5 min；然后94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s循環；72 ℃ 10 min。在含EB代用品的10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，用紫外分光度法觀察結果。(2)PCR擴增產物在含EB替代物的10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，用UV燈觀察，并與標記物進行酶切比較。(3)PCR產物直接作為酶切底物，反應的步驟和方法參照各內切酶的說明，在30 g/L瓊脂糖凝膠上電泳2 h。

表2 引物序列

1.3統計學處理 采用SPSS19.0分析，以Hardy-Weinberg平衡檢驗分析研究樣本的群體代表性計算每組的基因型頻率和等位基因頻率。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1TNF-α-308G/A多態性的分析 利用TNF-α-308G/A多態性擴增了含-308位點的α，擴增產物為346 bp，如果-308位點為G，則將其切成24 bp和322 bp兩個片段，因為該24 bp片段太小，不能在瓊脂糖上看到，因此，只有一個322 bp的片段，如果-308位點是一個，就不會出現。用NCOI內切酶切，片段長度為346 bp，純合子GA基因型為322 bp，雜合子基因型為322 bp/346 bp，純合子AA基因型為346 bp1,見圖1。

注：M為DNA標記物

2.2CD40-rsl883832位點的酶切結果 在CD 40基因的rsl883832位點上，C或T堿基發生了變化，根據限制性內切酶NCOⅠ限制性內切酶片段，有多種基因型，見圖2。

注：M為DNA標記物

2.3CD40-rs4810485位點的限制性酶切 CD 40基因的rs4810485位點有C或G的變化。根據限制性內切酶MSPL片段，有3個基因型:GG (272、163 bp)和CC(435 bp)、CG (435、272、163 bp)，見圖3。

注：M為DNA標記物

2.4TNF-α-308G/A、CD40-rsl883832、CD40-rs4810485位點的多態性分析 乙型肝炎后肝硬化患者和健康對照者相比較，肝硬化患者的TNF-α-308G/A的GA基因型明顯高于健康者，差異有統計學(P<0.05)。肝硬化患者的CD40-rsl883832的CT、TT基因型明顯高于健康者，差異有統計學(P<0.05)。TNF-α-308G/A的AA、GG基因型、CD40-rsl883832的CC基因型、CD40-rs4810485的基因型差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 TNF-α-308G/A、CD40-rsl883832、CD40-rs4810485位點的多態性分析(n)

3 討論

乙型肝炎后肝硬化的發病機制主要與乙肝病毒的感染和侵襲有關，也與患者的遺傳易感性和免疫功能有關，在研究乙肝后肝硬化的遺傳易感性過程中，TNF-α的產生受遺傳因素的控制，TNF-α是第一種由炎性反應機制產生的細胞因子[8]。TNF-α主要由以下幾個部分組成：單核細胞Kupffer細胞與其他細胞因子共同促進肝星狀細胞的增殖和纖維增殖，抑制肝細胞的生長，阻止肝細胞的再生，參與肝硬化的形成和發展。持續高水平的α誘導可促進肝星狀細胞的增殖和纖維增生，體外研究表明腫瘤壞死因子-α啟動子-308a的等位基因與肝硬化的增加有關[9]。此次研究結果顯示乙型肝炎后肝硬化患者和健康對照者相比較，肝硬化患者的TNF-α-308G/A的GA基因型明顯高于健康者，差異有統計學意義(P<0.05)，提示TNF-α-308G/A可作為肝硬化的診斷及治療療效評估。既往研究顯示HBVDNA陽性患者的TNF-α含量明顯高于陰性組，且提示TNF-α啟動子區-308G/A基因型及等位基因在健康人與乙肝肝硬化以及慢重肝3種不同HBV慢性感染臨床類型中分布頻率之間的差異。且在重度乙肝、乙肝肝硬化、慢性重型肝炎及原發性肝癌患者的血清學檢測發現TNF-α均處于高活性狀態，其含量明顯高于慢乙肝輕度患者，并且發現它的含量與病毒復制活躍有關。漢族人群中TNF-α基因多態性與不同慢性肝病的關系本研究在一定程度上反映了TNF-α-308G/A的GA基因型可以作為肝硬化的預測指標[10]。

乙型肝炎的發病機制非常復雜，目前認為宿主免疫功能障礙是其病理損害的主要原因，而T細胞是免疫系統的重要組成部分，它的激活不僅需要直接刺激外源抗原，還需要細胞間表面分子的相互作用來傳遞共刺激信號[11-12]。CD40-CD40L通路是另一種重要的途徑，它不僅參與和維持正常生理狀態中許多重要的生理功能，許多病理過程往往是由該通路的失調或紊亂以及低或無能力引起的[13]。單用CD 40單克隆抗體也能促進B細胞的增殖，使B細胞表面的許多黏附分子具有較高的親和力，導致細胞聚集，從而促進T細胞的相互作用[14]。此次研究結果提示CD40-rsl883832可作為肝硬化的診斷及治療療效評估。肝硬化患者的CD40-rsl883832的CT、TT基因型明顯高于健康者，差異有統計學意義(P<0.05)。既往研究顯示CD40的陽性表達在正常脾臟與巨脾組織中存在顯著差異，而且其表達隨肝功能不全的加重和巨脾分級增高而逐漸降低。這表明肝硬化門靜脈高壓癥時巨脾的免疫功能狀態處于明顯低下的狀態，CD40有可能成為一種術前判定肝硬化及脾臟免疫功能的有價值的檢測指標，對于指導肝硬化門靜脈高壓癥術中脾臟的處理方式提供了一定的試驗依據[15]。TNF-α-308G/A的AA、GG基因型、CD40-rsl883832的CC基因型、CD40-rs4810485的基因型差異無統計學意義(P>0.05)。

4 結論

綜上所述，乙型肝炎后肝硬化患者的TNF-α-308G/A的GA基因型明顯高于健康者，TNF-α-308 a、CD40-rsl883832基因可以選為肝硬化易感基因的遺傳標記，應用前景廣泛。