白細胞介素23在子宮內(nèi)膜息肉中的表達及臨床意義*

周 寧，富 饒，黃諳非，劉勇軍，謝小軍△

(南方科技大學(xué)醫(yī)院：1.檢驗科；2.病理科，廣東深圳 518028；3.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，廣東東莞 523808)

子宮內(nèi)膜息肉(EP)是女性常見的婦科疾病之一，有文獻報道在人群中的發(fā)病率約為7.8%～34.9%，其起源于基底層細胞的良性局限性增生，主要由纖維化的間質(zhì)、厚壁血管和囊樣擴張的腺體組成[1]。子宮內(nèi)膜息肉可導(dǎo)致陰道異常出血、月經(jīng)不規(guī)律、不孕，甚至國外研究報道子宮內(nèi)膜息肉的惡變率高達5.6%[2]，但其發(fā)病機制尤其是分子生物學(xué)的機制依然知之甚少。近年來研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)生與炎癥存在相關(guān)性，但國內(nèi)外對子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)生與炎癥因子異常表達是否有關(guān)的研究報道較少，IL23是一個炎性細胞因子，IL23的異常表達與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展存在密切聯(lián)系，越來越多的證據(jù)表明IL23參與了鼻息肉、胃腸道息肉等多種組織的炎癥過程，但在子宮內(nèi)膜息肉中IL23與其是否也存在相關(guān)關(guān)系至今未見相關(guān)報道[3]。為此，本研究通過檢測IL23在子宮內(nèi)膜息肉中的表達及分析IL23與患者各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，探索子宮內(nèi)膜息肉發(fā)生發(fā)病的機制，以期為臨床的診斷和治療提供進一步的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年4月至2018年4月于南方科技大學(xué)醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的患者，宮腔鏡下切除并經(jīng)病理學(xué)檢查確診為子宮內(nèi)膜息肉組織共60例，同一患者經(jīng)病理確診為正常子宮內(nèi)膜組織共48例。以上患者手術(shù)前3個月內(nèi)沒有接受過任何激素類藥物治療，且不患其他婦科相關(guān)疾病如子宮肌瘤、子宮腺肌癥等。收集以上標本時，均經(jīng)過患者本人同意并簽署知情同意書。以上患者的臨床病理信息如患者年齡、陰道不規(guī)則出血、陰道分泌物檢查情況、孕次、產(chǎn)次、息肉直徑、息肉位置等收集于住院時記錄的病歷。

1.2方法

1.2.1標本制作 標本用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋制作切片，HE染色核實病理診斷。

1.2.2免疫組化染色 石蠟切片60 ℃烤1 h，二甲苯脫蠟后再梯度乙醇脫水，置入枸櫞酸鈉溶液中進行抗原修復(fù)，浸入3%H2O2以消除過氧化物酶的活性，用羊血清封閉30 min后用IL23的Ⅰ抗室溫孵育30 min(博奧森公司)，PBS洗滌3次，室溫下加Ⅱ抗孵育，DAB溶液顯色，蘇木素溶液復(fù)染，然后風(fēng)化、返藍、脫水、透明，最后封片。每次實驗均在同樣的條件下進行，以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。

1.2.3免疫組化的結(jié)果評分標準 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由兩位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生在雙盲條件下采用半定量免疫反應(yīng)評分系統(tǒng)進行評定，并對不一致的結(jié)果重新判斷直至判定的結(jié)果統(tǒng)一。綜合染色強度和染色面積進行結(jié)果判斷，染色強度的評分標準為：0分為不著色，1分為淡棕黃色，3分為深棕黃色，2分為介于兩者之間。每張切片隨機抽取4個高倍視野，計算染色面積，染色面積評分標準為：0分為<10%，1分為10%～<40%，2分為40%～70%，3分為>70%。兩種評分的乘積即為陽性強度，范圍為0～9，當評分≥3為表達陽性，評分<3為表達減弱或陰性[3]。

1.2.4蛋白印跡實驗 隨機選取宮腔鏡下切除的3例子宮內(nèi)膜息肉組織為實驗組，同一患者診刮下來的正常子宮內(nèi)膜為對照組，抽提蛋白，進行蛋白印跡實驗。在約30 mg子宮內(nèi)膜組織中加入300 μL RIPA裂解液，在研缽中充分研磨，按照說明書提取總蛋白并進行蛋白濃度的測定。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)到PVDF膜，脫脂牛奶封閉1 h，4 ℃冰箱Ⅰ抗孵育過夜(Abcam公司)，PBST洗滌3次，加Ⅱ抗，室溫孵育1 h，PBST漂洗3次，采用底物化學(xué)發(fā)光，用化學(xué)發(fā)光成像分析儀檢測目的條帶。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料采用構(gòu)成比表示，兩組間比較采用χ2檢驗，IL23與患者各臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1IL23蛋白在子宮內(nèi)膜息肉和正常子宮內(nèi)膜的表達 免疫組化的結(jié)果顯示IL23蛋白表達主要定位于子宮內(nèi)膜腺上皮細胞和間質(zhì)細胞的細胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒。IL23蛋白在正常子宮內(nèi)膜組中的陽性表達率明顯高于子宮內(nèi)膜息肉組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(71.7%vs. 28.3%，P<0.001)，見表1、圖1。

表1 IL23蛋白在正常子宮內(nèi)膜組和子宮內(nèi)膜息肉組中的表達[n(%)]

注：A和B表示正常子宮內(nèi)膜組織中IL23陽性表達(×200、×400)；C和D表示子宮內(nèi)膜息肉組織中IL23陰性表達(×200、 ×400)

蛋白印跡實驗結(jié)果表明IL23在子宮內(nèi)膜息肉組中的表達水平較正常子宮內(nèi)膜組水平下降，差異有顯著性(P<0.05)，與免疫組化染色結(jié)果一致，見圖2。

2.2子宮內(nèi)膜息肉中IL23的表達與患者各臨床病理參數(shù)的關(guān)系 陰道分泌物鏡檢異常包括檢出滴蟲、真菌、線索細胞和白帶清潔度為Ⅲ或Ⅳ度；患者陰道異常出血表現(xiàn)為經(jīng)期延長或縮短、經(jīng)量增多、不規(guī)則陰道流血、痛經(jīng)、絕經(jīng)后陰道出血等。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析比較IL23與患者各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn) IL23表達水平與陰道分泌物鏡檢異常(68.33%vs. 31.67%,r=-0.298，P=0.035)和陰道不規(guī)則出血成負相關(guān)(63.93%vs. 36.07%，r=-0.258，P<0.05),但其與患者年齡、孕次、產(chǎn)次、子宮內(nèi)膜息肉位置、息肉直徑和息肉個數(shù)均無顯著的相關(guān)性(P>0.05)，見表2。

注：A為使用蛋白印跡實驗檢測GAPDH和IL23蛋白水平；B 為使用Image J 灰度分析軟件評估正常子內(nèi)膜組和子宮內(nèi)膜息肉組中IL23/GAPDH比值

表2 子宮內(nèi)膜息肉中IL23表達及其與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

3 討論

子宮內(nèi)膜息肉是婦科常見疾病，其可因使受精卵著床失敗而引起不孕，研究發(fā)現(xiàn)多發(fā)性息肉比單發(fā)息肉患者經(jīng)宮腔鏡切除后復(fù)發(fā)風(fēng)險更高，甚至其可過度增生至惡變，因此探索子宮內(nèi)膜息肉發(fā)病機制對提高其檢出率和治療效果至關(guān)重要[4]。實驗首次證實了IL23在子宮內(nèi)膜息肉中表達下調(diào)，且表達水平下調(diào)的IL23更常見于陰道分泌物鏡檢異常和不規(guī)則陰道流血的患者。

目前已知與子宮內(nèi)膜息肉發(fā)病機制密切相關(guān)的因子有：胰島素樣生長因子、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、血管內(nèi)皮細胞生長因子等[5-6]。LOPES等[7]研究證實雌激素和孕激素受體在子宮內(nèi)膜息肉中表達水平比正常內(nèi)膜組織升高。在以往的研究中，雖發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜息肉與炎癥之間存在相關(guān)關(guān)系，子宮內(nèi)膜息肉患者同時存在子宮內(nèi)膜炎顯著性增加，但子宮內(nèi)膜息肉患者與炎癥因子之間的相關(guān)關(guān)系未見相關(guān)研究報道，具體的分子機制仍不明確。IL23是近年來研究較多的炎癥因子之一，其與息肉的研究主要集中于鼻息肉、鼻竇息肉、宮頸息肉和腸息肉等，而子宮內(nèi)膜息肉與IL23蛋白之間的關(guān)系未知[3,8-9]。

IL23是IL12家族中新發(fā)現(xiàn)的一個異源二聚體細胞因子，由p19和p40兩個亞基組成，其中，p40與IL-12中的p40具有同源性，人活化的樹突細胞、巨噬細胞、T細胞和內(nèi)皮細胞都能產(chǎn)生IL-23[10-11]。此研究通過免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜的腺上皮細胞和間質(zhì)細胞的細胞質(zhì)也被染成棕黃色，表明子宮內(nèi)膜的腺細胞和間質(zhì)細胞也能產(chǎn)生IL23，但其具體產(chǎn)生機制需要進一步的研究。IL23是炎性細胞因子，參與了關(guān)節(jié)、鼻、鼻竇、子宮頸和腸道等多種組織的慢性炎性反應(yīng)，并在局部組織重塑過程中起重要作用[12-13]。丁國臣等研究發(fā)現(xiàn)IL23p19mRNA在鼻息肉中表達水平明顯高于鼻甲黏膜組織[8]。基因微陣列發(fā)現(xiàn)IL23p40DNA在宮頸息肉和宮頸內(nèi)膜中存在差異，蛋白印跡方法進一步驗證了宮頸息肉中IL23p40表達水平較正常組升高[9]。從骨關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)分離的滑膜細胞在體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)阻斷IL23可以抑制促炎因子TNF-α、IL-1B、和IL6的產(chǎn)生[14]。與野生型小鼠相比，IL-23p19缺失的小鼠慢性腸道炎癥性疾病的發(fā)病率降低。Kaiqa T在體外實驗中研究發(fā)現(xiàn)IL23通過Th1細胞能夠增強宿主對病原微生物的免疫性和防御能力。研究報道IL-23的主要生物學(xué)功能是調(diào)解新的CD4+T細胞(Th17細胞)產(chǎn)生IL-17，形成IL-23/IL-17軸而在慢性炎性反應(yīng)性疾病中發(fā)揮重要作用[15]。IL17在抗炎抗腫瘤免疫中是一把雙刃劍，其既可以通過促進血管的生成和增加細胞免疫逃逸功能促進腫瘤的生長，也可以通過招募中心粒細胞、NK細胞和CD4+和CD8+T細胞到腫瘤組織而發(fā)揮抗炎抗腫瘤的作用[16]。有研究發(fā)現(xiàn)IL17和抗炎癥細胞因子IL37之間存在相關(guān)關(guān)系，在子宮內(nèi)膜異位癥中IL37過度表達可以減少炎性相關(guān)因子的表達如IL-1B、IL6、IL10，甚至可以抑制子宮基質(zhì)細胞的增殖、黏附、遷移、侵入及MMP-2和PPP-9的活性[17]。而本研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜息肉中IL23表達下調(diào)，表明IL23在子宮內(nèi)膜息肉中可能發(fā)揮了抗炎癥抗息肉形成的作用。綜上所述，IL23在子宮內(nèi)膜息肉中是否通過IL17而發(fā)揮抗炎癥抗息肉的作用機制有待進一步的研究與確定。

國外研究發(fā)現(xiàn)用ELISA法檢測念珠菌陰道炎患者陰道分泌物中 IL23p19的水平，結(jié)果顯示陰道念珠菌病患者的IL23p19表達水平顯著低于正常組，表明念珠菌屬真菌感染陰道可能使IL23分泌減少，IL23在念珠菌病陰道炎中可能起了保護的作用[18]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL23的表達與陰道分泌物鏡檢異常存在負相關(guān)，是否念珠菌等病原微生物所致陰道炎可能逆行上行至子宮內(nèi)膜，不斷炎癥刺激使IL23表達下調(diào)，刺激子宮內(nèi)膜組織不斷增生導(dǎo)致息肉的形成，但其具體作用機制有待進一步的研究。子宮內(nèi)膜息肉最常見的臨床癥狀為陰道不規(guī)則流血，也是患者就診最常見的原因，本研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜息肉患者中IL23表達在陰道不規(guī)則流血和陰道未發(fā)生不規(guī)則流血建有差異，但具體機制不明，有待將來研究的進一步闡明。

4 結(jié)論

本研究初步推測IL23的下調(diào)可能參與了子宮內(nèi)膜息肉的形成，為后續(xù)深入研究奠定基礎(chǔ)。同時，IL23與患者陰道炎和陰道不規(guī)則流血存在相關(guān)關(guān)系，值得進一步的關(guān)注。