可溶性fms樣酪氨酸激酶-1熒光免疫層析法檢測的臨床性能評估

蘇 倩，管世鶴，張 妤，周 強，范懿雋，付娟娟，傅柳陶，黃才敏，陸義紅，張麗麗，張婉瑩，儲雯雯，韋 玉，吳園園

(安徽醫科大學第二附屬醫院，安徽合肥 230601)

孕婦血清中的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1(sFlt-1)屬于Ⅲ型受體酪氨酸激酶家族，分子量約為63.6kD[1]；由細胞外區1～6個免疫球蛋白樣結構域構成，不含酪氨酸激酶域，編碼區與fms樣酪氨酸激酶-1(Flt-1)的胞外區完全一致，能與膜表面受體競爭結合血管內皮生長因子(VEGF)。最初于類臍靜脈內細胞上被發現sFlt-1作為VEGF和胎盤生長因子(PLGF)的直接抑制物，血清水平升高則可導致胎盤滋養細胞及血管生長不良，從而導致內細胞損傷。sFlt-1主要通過與VEGF和PlGF結合，介導VEGF和PlGF的生物學功能，參與血管的形成、重塑和再植等作用。因而，sFlt-1與子癇前期的預測已成為研究焦點[2]。sFlt-1與PLGF是首個經過大規模臨床試驗驗證的、可用于孕婦子癇前期預測及診斷的生化標志物[3]，血清sFlt-1與PLGF濃度的變化與孕婦罹患子癇前期的風險密切相關。目前，PLGF的檢測已有酶聯免疫吸附(ELISA)、時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)、微流控(Microfluidics)、電化學發光法(ECL)[4-5]等報道；而sFlt-1的檢測報道較少，主要是羅氏的電化學發光法。考慮到熒光免疫層析技術成本低，準確性高，操作簡便、快速，可實現隨到隨診，方便臨床應用，具有較高的臨床應用價值，本研究對熒光免疫層析法的sFlt-1檢測試劑盒進行分析性能評價，以了解該試劑盒是否滿足臨床應用的需求。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年2-9月來本院就診的孕婦(年齡：18～45歲、孕周：20～34+6周)，共152例；經檢測血清sFlt-1濃度覆蓋待評估試劑盒的線性區間40～85 000 pg/mL；按照羅氏電化學發光分析系統的檢測結果，152例血清sFlt-1濃度分布為sFlt-1≤3 000 pg/mL共97例，>3 000 pg/mL共55例(3 000 pg/mL為20孕周以上的健康孕婦P95百分位數的參考值)。樣本來自于臨床常規檢測剩余血清。

1.2儀器與試劑 羅氏全自動化學發光免疫分析儀(cobas6000 e601)及sFlt-1檢測試劑盒(電化學發光法，批號：23042701)；熒光分析儀(廣州藍勃生物科技有限公司，AFS-1000)及sFlt-1檢測試劑盒(熒光免疫層析法，批號：20170417-01)為江蘇凱基生物技術股份有限公司產品，sFlt-1重組蛋白采購自無錫金泰格生物科技有限公司。

1.3方法 sFlt-1電化學發光法的檢測，是基于釕(Ru)標記和磁微珠法的雙抗體夾心的原理，檢測試劑與樣本中的sFlt-1蛋白形成 “抗體-抗原”復合物，施加電壓后產生發光信號，采用電化學發光分析檢測信號的強度，樣本中的sFlt-1蛋白濃度成正相關。

sFlt-1熒光免疫層析法的檢測，同樣是基于雙抗體夾心法的原理，將鼠抗人sFlt-1抗體作為標記抗體(用熒光微球標記)，另一鼠抗人sFlt-1F單克隆抗體劃在載體膜(硝酸纖維素膜)作為檢測線抗體，制備成檢測卡；檢測時，將80 μL樣本加入檢測卡中的樣品孔中，樣本中的sFlt-1蛋白首先與熒光微球標記的抗體結合，然后經過載體膜的層析泳動作用，再被檢測線上的鼠抗人sFlt-1單克隆抗體吸附；加樣15 min后通過熒光分析儀檢測對應條帶的熒光強度，結合標準曲線，計算出樣本中sFlt-1的濃度。

參照美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)EP5-A、EP6-A、EP7-A、EP15-A文件[6-9]要求，以羅氏的sFlt-1電化學發光試劑盒的檢測結果為準，對sFlt-1熒光免疫層析法檢測試劑盒的分析性能進行評價，具體方法如下。

1.3.4回收實驗 將高濃度的sFlt-1質控品A(10 μL)分別加入到基質B(100 μL)中，各測試1次，計算回收率R，應在85%～115%。

1.3.6方法學比對 采用羅氏的sFlt-1試劑盒作為比對的參比方法。本次臨床性能評價共檢測樣本152例，樣本類型為血清；同一份臨床樣本采用本項目待評價的熒光免疫層析檢測試劑盒與參比方法平行試驗；考察本項目待評價的熒光免疫層析檢測試劑盒與參比方法的相關性R2，應不低于0.950。

以羅氏的sFlt-1試劑盒作為比對的參比，以3 000 pg/mL作為臨界值，計算熒光免疫層析試劑盒的臨床性能指標，包括相對靈敏度、相對特異性、總體符合率等。

2 結果

2.4回收實驗 sFlt-1檢測顯示，原始濃度和檢測濃度分別為93 540、8 617 pg/mL，計算得到sFlt-1熒光免疫層析法檢測試劑盒的回收率為101.33%。據此確定sFlt-1熒光免疫層析法檢測試劑盒的回收率在85%～115%的范圍內。

2.5干擾物質 實驗結果顯示，血紅蛋白等干擾物質在生理高濃度的情況下，對sFlt-1臨床樣本的干擾率均在-8%～8%的范圍內，則認為血紅蛋白等干擾物質在上述濃度條件下，對本研究的sFlt-1測定方法沒有干擾作用，見表2。

表1 sFlt-1熒光免疫層析法檢測試劑盒線性研究結果(pg/mL)

注：H為高值樣本，L為低值樣本

圖1 sFlt-1熒光免疫層析法檢測試劑盒的線性相關性

表5 干擾物質對檢測結果的影響(ng/mL)

2.6方法學比對 方法學比對試驗共檢測了152例血清樣本，熒光免疫層析法sFlt-1檢測試劑盒每個樣本測定值與相對應的羅氏電化學發光法sFlt-1檢測試劑盒測定值作散點圖，以熒光免疫層析法sFlt-1檢測試劑盒(考核系統)作Y軸，羅氏電化學發光法sFlt-1檢測試劑盒(參比系統)作X軸，見圖2。線性回歸方程：Y=1.023X-76.67，R2=0.970(>0.950)，斜率b=1.023，95%CI=-163.684～10.344；截距a=-76.67,95%CI=0.994～1.053；兩個系統之間的相關系數r=0.985，表明兩種檢測方法一致性良好，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 sFlt-1回歸分析

152例樣本的測定值以3 000 pg/mL作為臨界值進行定性分析，結果顯示，熒光免疫層析法sFlt-1檢測試劑盒相對于羅氏電化學發光法sFlt-1檢測試劑盒的檢測靈敏度為90.91%，相對特異性為100%，相對總體符合率為96.71%，見表6。

表6 以3 000 pg/mL為臨界值對試劑盒檢測結果的定性分析(n)

3 討論

sFlt-1作為子癇前期發病機制、預測和診斷的重要生物標志物[10-13]，臨床應用中一直缺乏合適的檢測方法，目前僅有進口的試劑盒(瑞士羅氏的電化學發光法)；該試劑盒成本高，依賴大型分析設備，存在較大的普及困難。

熒光免疫層析技術是近年來興起的一種快速免疫學檢測方法[14-15]，靈敏度高，操作便捷，綜合成本低，適合在臨床科室進行現場檢測，同時也是檢驗科的一種重要輔助技術手段，適用于檢測量不大的項目，節省成本，提高工作效率。

本研究評估了基于熒光免疫層析技術建立的血清中sFlt-1的檢測試劑盒，包括依據CLSI的EP5-A、EP6-A、EP7-A、EP15-A等規范性文件，對熒光免疫層析檢測試劑盒的分析性能，包括：空白限、回收實驗、線性范圍、精密度和干擾試驗，進行了驗證：空白限≤12 pg/mL，而線性范圍為40～85 000 pg/mL，兩項技術參數達到了臨床應用的要求；采用回收率作為回收實驗評價的方法，經檢測，回收率為101.33%；熒光免疫層析檢測試劑盒的精密度(CV)：高值樣本為3.63%，低值樣本為5.92%，均符合熒光免疫層析檢測試劑盒的技術要求；最后通過加入血紅蛋白、類風濕因子等常見的干擾物質，證實在生理高濃度的情況下，不會對sFlt-1的檢測結果造成干擾。最后，通過152例的臨床樣本，與羅氏的電化學發光法試劑盒進行對比研究，實驗結果證實，本項目待評價的熒光免疫層析檢測試劑盒與電化學發光法的符合率高，檢測結果的相關性為0.985(>0.950)，證實本項目的sFlt-1熒光免疫層析檢測試劑盒與電化學發光法試劑盒具有良好的一致性。

4 結論

本研究對基于熒光免疫層析技術的sFlt-1檢測試劑盒的臨床性能，如，精密度、線性范圍、方法學比對等，進行了全面評估，證實其均能達到臨床應用的需求，具有重要的臨床意義。