TRFIA法檢測HBV表面抗原最佳臨界值及灰區探討

葉 莎,魏 娜

(1.巴音郭楞蒙古自治州人民醫院檢驗科，新疆庫爾勒 841000;2.北京市中西醫結合醫院檢驗科,北京 100089)

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種全球性的流行病，而其是我國感染人數最多、流行最廣泛、危害最嚴重的病毒性肝炎之一。HBV感染最先出現的標志物是HBV表面抗原[1]，因此，HBV表面抗原的檢出有利于乙型肝炎的早期診斷、治療及預防傳播。HBV表面抗原常用的檢測方法是 ELISA 方法,但由于ELISA法檢測影響因素較多，近幾年實驗室逐漸開展時間分辨熒光免疫試驗(TRFIA)檢測HBV表面抗原,其原理是采用雙抗體夾心時間分辨熒光分析法，以單克隆抗體包被反應板，鑭系元素Eu3+標記抗體，并與時間分辨測定技術相結合建立起來的一種新型非放射性微量分析技術[2]。該方法具體靈敏度高、發光穩定、壽命延長、自然熒光干擾少等優點[3]。HBV表面抗原定量試劑已由最初的一代試劑發展為二代試劑，其檢測的敏感性顯著的提高，同時假陽性率是否會增高？各廠家試劑產品說明書提供的臨界值不盡相同，同時試劑廠家所使用的定值參考人群也不同[4]，因此，需要對臨界值進行設定。此外，在臨床工作中發現，根據廠家給定的臨界值(0.05 IU/mL)判斷檢驗結果，易出現假陽性，導致部分患者的誤診，會引起患者及家屬的恐慌，造成巨大的負面影響。由于TRFIA法靈敏度高，從而有一部標本呈現弱陽性，即灰區。研究報告[5-6 ]指出灰區的標本容易漏診或誤診。目前，關于TRFIA檢測乙肝表面抗原臨界值及灰區鮮見報道，因此，本研究根據本實驗條件，探討TRFIA法檢測乙肝表面抗原的最佳臨界值及灰區，制定適合本實驗室最佳臨界值和灰區，為臨床乙型肝炎病毒感染的診斷提供可靠依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2018年6月來某三甲醫院住院患者或體檢者血清或血漿經TRFIA檢測乙肝表面抗原陽性的標本150例和接近臨界值(陰性)標本30例，其中定量值在0.03～<0.05 IU/mL有30例，0.05～<0.10 IU/mL有50例，0.1～<0.2 IU/mL有40例，0.2～<0.5 IU/mL有30例，0.5～1.0 IU/mL有30例。所有標本均無任何凝集不完全、溶血、黃疸及脂血現象。

1.2儀器與試劑 蘇州新波EasyCuta全自動時間分辨熒光免疫分析儀及配套HBV表面抗原診斷試劑盒，雅培Architect i2000化學發光微粒子免疫分析系統及配套HBV表面抗原診斷試劑,所有試劑均在有效期內。每日使用兩個水平的質控品監測質控情況，兩質控品的濃度分別是0.5 IU/mL和1 IU/mL(北京康徹思坦公司生產),批號均是201803001。

1.3方法

1.3.1精密度的評價 批內精密度用TRFIA檢測法對兩濃度水平的質控品在同一批次內平行檢測20次，記錄定量值，然后計算均值、s和CV(標準為CV不大于10%[7])。批間精密度在批內精密度符合要求的基礎上，用TRFIA檢測法對兩濃度水平的質控品連續檢測20天,每天平行檢測復孔，記錄其定量值，然后計算均值、標準差(s)和變異系數(CV,標準為CV不大于10%[7])。

1.3.2TRFIA檢測HBV表面抗原 專業人員嚴格遵守Easycuta全自動時間分辨熒光分析儀操作規程進行操作。有校準品從A至F,依次為校準品A:空白；校準品B：0.05 IU/mL；校準品C:0.20 IU/mL；校準品D：2.00 IU/mL校準品E：20.00 IU/mL；校準品F:150.00 IU/mL。試劑說明書臨界值建議濃度為0.05 IU/mL。

1.3.3HBV表面抗原確證試驗 采用化學發光微粒子免疫分析法(CMIA)進行確認，專業人員嚴格按照Architect i2000化學發光微粒子免疫分析儀操作規程進行操作。所有標本均檢測兩次，兩次檢測結果均≥0.05 IU/mL時為陽性；兩次結果不一致時，重復檢測一次，三次均值≥0.05 IU/mL為陽性，反之為陰性。

1.4統計學處理

1.4.1利用統計學軟件SPSS19.0錄入數據，TRFIA法檢測結果與確認試驗結果比較采用四格表Fisher確切概率法。繪制ROC曲線，判定最佳臨界值。利用公式臨界值±2CV[8]，計算其灰區，這里的CV為批間精密度變異系數。

1.4.2TRFIA法檢測結果與確認試驗一致性比較采用Kappa值來表示，Kappa的計算參考文獻[9]。

2 結果

2.1批內、批間精密度評價 兩濃度水平的質控品，按照1.3.1方法檢測，批內精密度分別為6.82%和5.26%，批間精密度分別為8.29%和7.31%，見表1。

表1 批內、批間精密度評價

2.2TRFIA法檢測HBV抗原結果與確證試驗比較 TRFIA檢測HBV抗原濃度在0.03～0.05 IU/mL的30陰性標本，經確證1例陽性(占3.3%)，29例陰性(占96.7%)；濃度在0.05～1.00 IU/mL的150例陽性標本，經確證132例陽性(占88.0%)，18例陰性(占12.0%)，見表2。

表2 TRFIA法檢測HBV抗原結果與確證試驗比較

2.3TRFIA法檢測結果與確證試驗一致性的比較 根據1.4.2中的公式計算，TRFIA法檢測結果與確證試驗結果一致性的Kappa值為0.690，TRFIA法檢測結果與確證試驗比較，差異有統計學意義(χ2=4.774，P=0.039)，見表3。

表3 兩種方法結果比較(n)

2.4最佳臨界值判定 利用SPSS19.0軟件繪制ROC曲線見圖1，該曲線下面積為0.924，其與ROC曲線下面積0.5比較,差異有統計學意義(P<0.001)。計算約登指數,并以約登指數最大時，即0.794，其對應的切點為臨界值，此時臨界值為0.074 IU/mL。

圖1 ROC曲線

2.5新臨界值下TRFIA法檢測結果與確證試驗一致性的比較 根據1.4.2中的方法計算，此時的一致性Kappa值為0.814，見表4。

2.6灰區的判定 根據1.4.1中的計算公式得出，灰區(CV值取最大為10%),灰區為范圍-0.126～0.274 IU/mL。試劑說明書給定的灰區范圍為0.04～0.06，給定的臨界值為0.05 IU/mL，兩灰區上限或下限時靈敏度、特異度、假陽性率和假陰性率見表5?；覅^下限的設定是為了減少漏診率，減少假陰性的發生，而上限設定是為了減少誤診率，減少假陽性的發生。統計學認為小于或等于5%為統計學可接受范圍，因此，灰區的下限設定應滿足假陰性率≤5%，而上限是設定應滿足假陽性率≤5%，從而確定灰區為0.05～0.274 IU/mL，見表5。

表4 新臨界值下兩種方法結果比較(n)

表5 灰區上限/下限時的敏感性、特異性、假陽性率和假陰性率(%)

注：-表示下限時無法計算假陽性數或上限時無法計算假陰性數

3 討論

ELISA法是檢測HBV表面抗原的常規方法,但由于整個檢測過程受外部環境、溫度、檢測人員等多種因素的影響，因此，近幾年TRFIA方法逐漸走進實驗室，替代ELISA方法。TRFIA是一種新型非放射性微量分析技術，目前已在臨床檢測中廣泛使用。本研究首先評估全自動時間分辨熒光儀的檢測系統的精密度能否滿足定量實驗精密度的要求。采用濃度為0.5 IU/mL和1 IU/mL的質控品進行檢測，監測兩濃度水平的批內精密度CV分別為6.82%和5.26%，批間精密度CV分別為8.29和7.31%，均能滿足CV不大于10%的標準。

CMIA定量檢測HBV表面抗原是利用生物素標記抗-HBs技術、親和素標記磁性微珠包被技術及電化學發光技術相結合而建立的微量分析技術。該方法具有高度的靈敏度與特異性，解決低濃度的問題，檢測準確率高[10-11]。本研究利用CMIA法對TRFIA方法檢測定量濃度在0.03～1.00 IU/mL的180例標本進行確認，經確證133例陽性，47例陰性，TRFIA法檢測結果與確證試驗結果比較，差異有統計學意義(P<0.05)。利用Kappa系數評估TRFIA與確證試驗結果一致性，當Kappa值大于等于0.75時表明兩種方法的一致性較好；當Kappa值大于等于0.4，而小于0.75時，表明兩種方法的一致性一般；當Kappa值小于0.4時表明兩種方法一致性很差[12]。本實驗室TRFIA方法與確證試驗檢測結果一致性的Kappa值為0.690，表明兩種方法定性結果的一致性一般，因此，需要對臨界值進行調整。

ROC曲線法是較為實用、較為便捷的統計學方法,其能較準確的確定方法學的臨界點[13]。而常用約登指數來評價篩查試驗的真實性,其指數越大，說明該篩查實驗的真實性越好，準確性越高[7]。本實驗利用ROC曲線，取約登指數最大時的拐點，確定最佳臨界值為0.074 IU/mL，此時，ROC曲線下面積為0.924。ROC曲線下面積在0.5～1.0，而當ROC曲線下面積在 0.9～1.0時，才具有較高的診斷價值[14]。本實驗ROC曲線下面積為0.924，因此說明定量試驗有較高的診斷價值。在新的臨界值下，TRFIA方法與確證試驗一致性的Kappa值為0.814，大于0.75，表明此時，兩種方法的一致性較好，也提示新的臨界值有一定的臨床應用價值。

TRFIA方法相對于傳統的 ELISA 方法檢測的靈敏度有顯著的提高，但是同時也出現一定的弱陽性標本，即灰區，灰區范圍的設定非常重要，范圍設置過窄容易漏檢，過寬容易造成資源浪費。本研究根據臨界值±2CV法確定的灰區范圍為-0.126～0.274 IU/mL，灰區的下限-0.126 IU/mL，顯然不合理(所有陰性均可疑)，大于灰區上限的標本中有2.13%的假陽性率，小于5%統計學上可接受的誤差范圍。試劑說明書給定的灰區范圍為0.04～0.06 IU/mL,在小于灰區下限的標本中假陰性率為0%,小于5%統計學上可接受的誤差范圍。而大于灰區上限的標本中假陽性率為14.89%，大于5%統計學上可接受的誤差范圍，因此設置不合理。試劑說明書給定的臨界值為0.05 IU/mL，而以0.05 IU/mL作為灰區的下限時，小于灰區下限的標本中有1.50%假陰性率，小于5%統計學上可接受的誤差范圍。相比較于灰區下限0.04 IU/mL，0.05 IU/mL作為灰區的下限既能滿足統計學可接受的誤差范圍，又不至于灰區范圍過寬，導致資源的浪費。因此，綜合考慮，本研究得出本實驗室的灰區范圍為0.05～0.274 IU/mL，對本實驗室有較佳的參考意義。

4 結論

通過本研究發現本實驗室TRFIA法檢測HBV表面抗原的最佳臨界值0.074 IU/mL，灰區為0.05～0.274 IU/mL，與試劑說明給定臨界值的0.05 IU/mL，灰區0.04～0.06 IU/mL有一定的差別。因此，各實驗室應根據本實驗室的實際情況，對TRFIA法檢測HBV表面抗原的臨界值及灰區進行重新設定。對于定量值在灰區的標本，工作人員應與患者或其醫師溝通，了解情況后，綜合判斷，客觀報告“結果可疑，定期復查”。