雷公藤多苷促進斑馬魚肝臟損傷和氧化應激的實驗研究

付曉春 沈小莉 李紅群 朱家樂 蔣平

摘要：目的? 研究雷公藤多苷誘導斑馬魚肝臟損傷及氧化應激的作用。方法? 隨機選取正常3 dpf 野生型AB品系斑馬魚，分為7組：正常對照組、溶劑對照組（0.5% DMSO）、雷公藤多苷300、350、400、450和500 μg/ml濃度處理組，每組30尾斑馬魚。雷公藤多苷處理斑馬魚直至120 hpf（3 dpf～5 dpf），觀察記錄每個實驗組斑馬魚的死亡情況并計算死亡率，用Origin 8.0統計學軟件繪制最佳的“濃度-死亡率”效應曲線并分別計算雷公藤多苷對斑馬魚的MNLC和LC10。另隨機選取正常3 dpf野生型AB品系斑馬魚，分為5組：正常對照組、對乙酰氨基酚（8 mM）組、雷公藤多苷片42.5、128和383 μg/ml濃度組，每組60尾斑馬魚。藥物處理48 h后，每組隨機選取30條斑馬魚置于4%多聚甲醛固定，固定后將斑馬魚轉移到70%乙醇中，進行脫水、包埋、切片、HE染色和封片，在顯微鏡下對染色后的斑馬魚切片進行肝臟病理學分析;在雷公藤多苷處理48 h后，每組隨機取30尾斑馬魚收集并處理檢測樣本，檢測過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。結果? 雷公藤多苷對斑馬魚的MNLC為383 μg/ml，LC10為417 μg/ml。HE染色結果提示：對乙酰氨基酚對斑馬魚有明顯肝毒性，隨著雷公藤多苷片濃度增加，斑馬魚肝臟組織結構破壞程度增大。對乙酰氨基酚組、雷公藤多苷片42.5、128和383 μg/ml濃度組的斑馬魚體內CAT、SOD活力以及MDA含量，與正常對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結論? 雷公藤多苷可通過誘導氧化應激促進斑馬魚的肝損傷。

關鍵詞：雷公藤多苷;斑馬魚;肝損傷;氧化應激

中圖分類號：R285.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.05.024

文章編號：1006-1959（2019）05-0079-05

Abstract：Objective? To study the effects of tripterygium glycosides on liver damage and oxidative stress in zebrafish. Methods? Normal 3 dpf wild type AB strain zebrafish were randomly selected and divided into 7 groups： normal control group， solvent control group （0.5% DMSO）， tripterygium glycosides 300， 350， 400， 450 and 500 μg/ml concentration treatment group， each group of 30 zebrafish. Tripterygium wilfordii treatment of zebrafish up to 120 hpf （3 dpf～5 dpf）， observe the death of zebrafish in each experimental group and calculate the mortality， and use the Origin 8.0 statistical software to draw the best "concentration-mortality" The effect curves were calculated and the MNLC and LC10 of zebrafish were calculated for tripterygium glycosides. The normal 3 dpf wild type AB strain zebrafish were randomly selected and divided into 5 groups： normal control group， acetaminophen （8 mM） group， tripterygium glycosides 42.5， 128 and 383 μg/ml concentration group， each group 60 zebrafish. After 48 h of drug treatment， 30 zebrafish were randomly selected from each group and fixed in 4% paraformaldehyde. After fixation， the zebrafish were transferred to 70% ethanol for dehydration， embedding， sectioning， HE staining and sealing. The liver pathological analysis of the stained zebrafish sections was performed under microscope. After 48 hours of treatment with tripterygium glycosides， 30 zebrafish were randomly selected from each group to collect and process the test samples to detect catalase （CAT） and superoxide. Dismutase （SOD） activity and malondialdehyde （MDA） content. Results? Tripterygium glycosides had a MNLC of 383 μg/ml for zebrafish and 417 μg/ml for LC10. The results of HE staining indicated that acetaminophen had obvious hepatotoxicity to zebrafish. With the increase of the concentration of tripterygium glycosides， the damage of liver tissue structure of zebrafish increased. The CAT， SOD activity and MDA content of zebrafish in the acetaminophen group and tripterygium glycosides group 42.5， 128 and 383 μg/ml were not significantly different from those in the normal control group （P>0.05）. Conclusion? Tripterygium glycosides can promote liver damage in zebrafish by inducing oxidative stress.

Key words：Tripterygium glycosides;Zebrafish;Liver injury;Oxidative stress

雷公藤多苷是傳統中藥雷公藤的主要活性成分，具有清熱解毒、散腫消積、止血、殺蟲等功效，臨床主要應用于免疫增強型疾病，如腎小球腎炎、風濕性和類風濕性關節炎、系統紅斑狼瘡等[1-4]。由于歷史原因以及我國早期藥物安全性評價研究手段落后等原因，雷公藤及其制劑在未進行系統的安全性評價之前就已經廣泛應用于臨床，因此，其毒性特點在應用于人類之前未能完全暴露，導致雷公藤多苷在臨床應用幾十年后出現了大量的不良反應人群[5，6]。由于缺乏雷公藤多苷毒理學相關的研究資料，目前對于雷公藤多苷不良反應的預防手段非常有限，出現不良反應之后也只能停藥及對癥處理，這種現狀大大的限制了雷公藤多苷的應用。臨床已經報道的關于雷公藤及其制劑出現的不良反應主要有：①消化道不良反應[7，8]，如惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等;②血液系統不良反應[9，10]，如貧血、鼻出血、皮膚瘀斑、粒細胞缺乏癥等;③肝損傷[11-13]和腎損傷[14，15];④心血管系統損害[16，17]，癥狀主要變現為心悸、胸悶、房室傳導阻滯等;⑤生殖系統不良反應[18-20]，男性生殖系統損傷主要以精子數量減少、性欲減退為主，女性生殖系統損傷主要以月經周期紊亂、性欲減退、性激素含量改變等。

目前，對雷公藤多苷及其他制劑的不良反應進研究大多數均采用大、小鼠為研究對象。隨著中藥安全性評價要求和水平的提高，采用替代試驗已成為預測中藥毒性風險的一項重要途徑。其中采用斑馬魚替代大、小鼠開展中藥毒性研究因其具有研究周期短、資金投入低等優勢而越來越受新藥研發學者的重視。例如：Wiegand C等[24]利用斑馬魚評價了除草劑——阿特拉津的肝毒性。Braunbeck T等[25]在斑馬魚身上考察了γ-六氯化苯誘導的肝脂肪變性。但目前還未見采用斑馬魚為研究對象，考察雷公藤多苷對肝臟的損傷及氧化應激在其中的參與作用的報道。本研究主要考察不同濃度的雷公藤多苷對肝臟的損傷作用及氧化應激的促進作用，期望能為后續是否可采用斑馬魚作為模式生物系統研究雷公藤多苷的安全性提供參考。

1材料與方法

1.1實驗動物? 野生型AB品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。年齡為受精后3 d。斑馬魚均飼養于28℃的養魚用水中。實驗動物使用許可證號為：SYXK（浙）2012-0171。飼養管理符合國際AAALAC認證的要求。

1.2藥物與試劑? 二甲基亞砜（DMSO）：Sigma，France。雷公藤多苷片：浙江得恩德制藥股份有限公司，國藥準字Z33020422，保存于陰涼柜，臨用前用DMSO配制成100 mg/ml母液，按需稀釋，現配現用。對乙酰氨基酚：購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，白色粉末，批號為I1706064，臨用前用DMSO配制成 800 mM，現配現用。4%多聚甲醛：鼎國生物，批號：814001300。二甲苯：阿拉丁，批號：G1705032。蘇木素：碧云天，批號：C0107。伊紅：依赫生物，批號：YH00606。鹽酸：西隴化工股份有限公司，批號：140517。過氧化氫酶檢測試劑盒：碧云天，批號070618180802。總SOD活性檢測試劑盒：碧云天，批號052818180726。脂質氧化檢測試劑盒：碧云天，批號032318180730。

1.3主要儀器? 解剖顯微鏡：SZX7，OLYMPUS，Japan;精密電子天平：CP214，奧豪斯;滾輪切片機：貨號：KD-2258 金華科迪。多功能酶標儀：LB940，Berthold Technologies，Germany。

1.4方法

1.4.1雷公藤多苷最大非致死濃度（MNLC）和LC10的測定? 隨機選取正常3 dpf 野生型AB品系斑馬魚，分為7組，分別為：正常對照組、溶劑對照組（0.5% DMSO）、雷公藤多苷300、350、400、450和500 μg/ml濃度處理組，每組30尾斑馬魚。雷公藤多苷處理斑馬魚直至120 hpf（3 dpf～5 dpf），觀察記錄每個實驗組斑馬魚的死亡情況并計算死亡率（%），用Origin 8.0統計學軟件繪制最佳的“濃度-死亡率”效應曲線并分別計算雷公藤多苷對斑馬魚的MNLC和LC10。

1.4.2雷公藤多苷對斑馬魚肝臟結構的影響? 另隨機選取正常3 dpf野生型AB品系斑馬魚，分為5組，分別為正常對照組、對乙酰氨基酚（8 mM）組、雷公藤多苷片42.5、128和383 μg/ml濃度組，每組60尾斑馬魚。藥物處理48 h后，每組隨機選取30條斑馬魚置于4%多聚甲醛固定，固定后將斑馬魚轉移到70%乙醇中，進行脫水、包埋、切片、HE染色和封片。在顯微鏡下對染色后的斑馬魚切片進行肝臟病理學分析。

1.4.3雷公藤多苷對氧化應激生化指標的影響? 按照1.4.2所述分組給藥處理，在雷公藤多苷處理48 h后，每組隨機取30尾斑馬魚收集并處理檢測樣本，分別按照過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）試劑盒說明書檢測CAT和SOD活性及MDA含量。

1.5統計學處理? 采用SPSS19.0軟件處理數據，計量資料以（x±s）表示，數據分析采用方差分析和t檢驗，計數資料以（%）表示，采用？字2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1斑馬魚最大非致死濃度（MNLC）和LC10結果? 根據雷公藤多苷對斑馬魚的“死亡率-濃度”統計數據（表1），利用Origin軟件模擬得到雷公藤多苷對斑馬魚的MNLC為383 μg/ml，LC10為417 μg/ml;“死亡率-濃度”效應曲線見圖1。

2.2雷公藤多苷破壞斑馬魚肝臟結構的實驗結果? HE染色結果提示：對乙酰氨基酚對斑馬魚有明顯肝毒性，主要表現為細胞腫大，細胞核模糊且細胞間質變大;雷公藤多苷片濃度為42.5 μg/ml時，斑馬魚肝臟組織結構略有改變，組織間隙增大，對肝臟細胞影響不大;雷公藤多苷片濃度為128 μg/ml時，明顯破壞了斑馬魚肝臟組織結構，表現為組織結構紊亂，細胞質變大;雷公藤多苷片濃度為383 μg/ml時，明顯破壞了斑馬魚肝臟組織結構，表現為組織結構紊亂，細胞質變大，此外細胞核大小不一，見圖2。

2.3雷公藤多苷誘導斑馬魚肝細胞凋亡的結果

2.3.1對CAT的影響? 對乙酰氨基酚組斑馬魚體內CAT活力為0.159 units，與正常對照組（0.187 units）比較降低了15.00%，但差異無統計學意義（P>0.05），提示對乙酰氨基酚對斑馬魚體內CAT活力影響不顯著。雷公藤多苷片42.5、128和383 μg/ml濃度組斑馬魚體內CAT活力分別為0.156、0.146和0.152 units，與正常對照組比較分別降低了16.60%、21.90%和18.70%，但差異無統計學意義（P>0.05），提示雷公藤多苷片在本實驗濃度條件下對斑馬魚體內CAT活力影響不明顯，見圖3。

2.3.2對SOD的影響? 對乙酰氨基酚組斑馬魚體內SOD活力為0.082 U/mg蛋白，與正常對照組（0.083 U/mg蛋白）比較降低了1.20%，但差異無統計學意義（P>0.05），提示對乙酰氨基酚對斑馬魚體內SOD活力無影響。雷公藤多苷片42.5、128和383 μg/ml濃度組斑馬魚體內SOD活力分別為0.0104、0.063和0.083 U/mg蛋白，與正常對照組比較分別降低了25.30%、24.10%和0，但差異無統計學意義（P>0.05），提示雷公藤多苷片在本實驗濃度條件下對斑馬魚體內SOD活力影響不明顯，見圖4。

2.3.3對MDA的影響? 對乙酰氨基酚組斑馬魚體內MDA含量為0.0011 μmol/mg蛋白，與正常對照組（0.0014 μmol/mg蛋白）比較升高了27.30%，但差異無統計學意義（P>0.05），提示對乙酰氨基酚能增加斑馬魚體內MDA含量，但無明顯差異。雷公藤多苷片42.5、128和383 μg/ml濃度組斑馬魚體內MDA含量分別為0.0020、0.0018和0.0015 μmol/mg蛋白，與正常對照組比較分別升高了81.80%、63.60%和36.40%，但差異無統計學意義（P>0.05），提示雷公藤多苷片在本實驗濃度條件下能促進斑馬魚體內MDA含量，但無明顯差異，見圖5。

3討論

肝臟是人體非常重要的器官，也是體內最大的解毒器官，肩負著消化、代謝、解毒、凝血、免疫調節等重要的功能。作為體內最大的解毒器官，肝臟與藥物的代謝密切相關，當肝臟受到傷害時，肝臟相應的功能將受到影響。目前，關于雷公藤及其制劑導致肝臟損傷的作用機制主要有4種，分別為組織氧化應激損傷[26，27]、肝臟代謝紊亂[28]、誘導性肝細胞凋亡損傷[29，30]、肝藥酶抑制導致藥物蓄積損傷[31，32]。

氧化應激（oxidative stress，OS）是指體內氧化作用與抗氧化作用失去平衡，從而導致蛋白酶分泌增加、中性粒細胞發生炎性浸潤，產生大量氧化中間產物[33，34]。氧化應激被認為是導致機體衰老和疾病的一個非常重要的因素。氧化應激對機體是一種損傷性反應，出于自我保護，機體內存在抗氧化應激系統，它主要有兩部分組成：一類是酶抗氧化系統，主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）等;另一類是非酶抗氧化系統，包括維生素E、維生素C、谷胱甘肽、褪黑素、類胡蘿卜素、微量元素等。

為考察雷公藤多苷對斑馬魚肝臟是否具有損傷作用，本研究從以下三個方面進行了研究：①確定雷公藤多苷對斑馬魚的最大非致死濃度（MNLC）和LC10：根據不同給藥劑量、不同給藥時間斑馬魚的死亡情況，計算MNLC和LC10，再根據這兩個濃度去設置后續實驗用藥濃度。②組織學觀察：通過檢測不同劑量組斑馬魚的肝臟組織病理學，觀察細胞結構水平下肝臟的損傷情況。③肝臟氧化應激損傷檢查：當給藥后肝臟發生氧化應激時，體內自由基大量增加，此時體內的抗氧化系統會開始工作，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶、丙二醛（MDA）即為體內的抗氧化系統的重要成員，通過測定其含量可間接的反應機體氧化應激情況。結果提示：雷公藤多苷片濃度為42.5、128 、383 μg/ml時可明顯破壞斑馬魚肝臟組織結構。

綜上所述，雷公藤多苷可通過誘導氧化應激促進斑馬魚的肝損傷。

參考文獻：

[1]劉升.雷公藤多苷治療慢性特發性蕁麻疹效果分析[J].中國衛生標準管理，2018，9（18）：104-105.

[2]陳菁，王彤.雷公藤多苷片用于慢性腎炎治療的效果評價[J].中國處方藥，2018，16（9）：77-78.

[3]張紅，薛中柱.雷公藤多苷聯合甲氨蝶呤治療類風濕性關節炎短期療效研究[J].吉林中醫藥，2018，38（6）：660-663.

[4]王萍.雷公藤多苷聯合激素治療中度活動型系統性紅斑狼瘡的臨床效果分析[J].中國實用醫藥，2018，13（13）：99-100.

[5]楊冬梅，劉俊.雷公藤多苷臨床應用及不良反應的研究進展[J].中國醫院藥學雜志，2018，38（20）：1-6.

[6]印成霞.55例雷公藤多甙片/雷公藤多苷片致不良反應文獻分析[J].中國藥物警戒，2013，10（8）：478-482.

[7]趙葉.182例雷公藤多苷片不良反應分析及預防措施[J].山東中醫雜志，2012，31（8）：572-574.

[8]楊威，黃遠鏗，雷夏凌，等. 雷公藤多苷對消化道的毒性研究[C]//中國毒理學會第七次全國毒理學大會暨第八屆湖北科技論壇論文集.2015.

[9]曹艷，運乃茹，鄒愛英.雷公藤多苷片致不良反應的Meta分析[J].中國藥房，2018，29（1）：125-130.

[10]李向陽，張靜巖.雷公藤引起純紅細胞再生障礙性貧血1例[J].中國誤診學雜志，2010，10（22）：5537.

[11]羅嵐，江振洲，張陸勇.雷公藤多苷肝毒性發生機制及減毒相關研究進展[J].藥物評價研究，2017，40（10）：1504-1509.

[12]王曉東，葉桃，金城，等.雷公藤多苷肝毒性血清藥物化學的初步研究[J].中國現代中藥，2017，19（3）：362-371.

[13]羅嵐，俞沁瑋，江振洲，等.雷公藤多苷肝毒性機制及物質基礎研究[C]//2016年第六屆全國藥物毒理學年會論文集.2016.

[14]唐旭霞，諶晶晶，李斌，等.雷公藤多甙對斑馬魚聽毒性和腎毒性的實驗研究[C]//中華中醫藥學會耳鼻喉科分會第二十三次學術年會、世界中聯耳鼻喉口腔科專業委員會第九次學術年會論文集.2017.

[15]任強，岑國棟，高永翔.雷公藤多苷誘導大鼠腎細胞凋亡的NF-кB信號轉導通路機制研究[J].成都中醫藥大學學報，2011，34（2）：39-44.

[16]信長慧，張競超，張付菊.雷公藤多苷片對高脂小鼠血脂的影響[J].中國現代應用藥學，2018，35（9）：1351-1354.

[17]謝佳宏.雷公藤多苷對PCI患者冠脈支架內再狹窄發生率及遠期預后的影響[D].青島大學，2017.

[18]郭健敏，黃遠鏗，雷夏凌，等.雷公藤多苷對雄性SD大鼠生殖系統損傷的動態變化及其可能機制[J].中國藥理學與毒理學雜志，2018，32（6）：469-476.

[19]任獻青，鄭貴珍，蘇杭，等.菟絲子黃酮對雷公藤多苷片致生精細胞周期阻滯、凋亡及相關蛋白表達降低的影響[J].藥物評價研究，2018，41（1）：55-60.

[20]張婷婷，馬曉莉.雷公藤多苷致卵巢早衰1例[J].解放軍醫學院學報，2017，38（12）：1167-1168.

[21]張妍君.系統性紅斑狼瘡與狼瘡性腎炎的藥物治療進展[D].遵義醫學院，2018.

[22]馬一旻，卜建宏.狼瘡性腎炎的治療進展[J].醫學綜述，2018，24（7）：1334-1338.

[23]余志謀.類風濕性關節炎的臨床診斷及藥物治療進展[J].現代診斷與治療，2018，29（5）：704-705.

[24]Wiegand C，Pflugmacher S，Giese M，et al.Uptake， toxicity， and effects on detoxication enzymes of atrazine and trifluoroacetate in embryos of zebrafish[J].Ecotoxicol Environ Saf，2000，45（2）：122-131.

[25]Braunbeck T，Gorge G，Storch V，et al.Hepatic steatosis in zebra fish （Brachydanio rerio） induced by long-term exposure to gamma-hexachlorocyclohexane[J].Ecotoxicol Environ Saf，1990，19（3）：355-374.

[26]祿保平，胡丹華，楊曉慧.保肝解毒顆粒對雷公藤多苷致急性肝損傷小鼠自由基脂質過氧化反應的影響[J].西安交通大學學報（醫學版），2008，29（3）：333-335.

[27]Wheeler MD，Nakagami M，Bradford BU，et al.Overexpression of manganese superoxide dismutase prevents alcohol-induced liver injury in the rat[J].J Biol Chem，2001，276（39）：36664-36672.

[28]趙小梅，劉歆穎，續暢，等.基于LC-MS代謝組學的雷公藤多苷致肝毒性生物標志物的初步篩查[J].中國中藥雜志，2015，40（19）：3851-3858.

[29]Yao J，Jiang Z，Duan W，et al.Involvement of mitochondrial pathway in triptolide-induced cytotoxicity in human? normal liver L-02 cells[J].Biol Pharm Bull，2008，31（4）：592-597.

[30]Mei Z，Li X，Wu Q，et al.The research on the anti-inflammatory activity and hepatotoxicity of triptolide-loaded solid lipid nanoparticle[J].Pharmacol Res，2005，51（4）：345-351.

[31]劉史佳，劉子修，周玲，等.雷公藤活性成分對大鼠體內P450酶活性的影響[J].中國藥理學通報，2011，27（2）：276-280.

[32]夏軍，夏宗玲.雷公藤多苷對大鼠與人肝微粒體CYP3A酶活性的體外抑制作用[J].中國藥房，2015，26（4）：473-476.

[33]吳利平.氧化應激與心血管疾病關系的研究進展[J].中國處方藥，2017，15（7）：9-10.

[34]李健，司麗芳，李夢云，等.氧化應激損傷雄性生殖功能的研究進展[C]//中國畜牧獸醫學會動物解剖及組織胚胎學分會第十九次學術研討會論文集.2016.

收稿日期：2018-11-26;修回日期：2018-12-10

編輯/楊倩