芪蝎活血通絡湯對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的神經保護作用及SIRT1、PGC-1表達的影響?

馬 瑞 劉王波 周 平

（湖北省十堰市太和醫院，湖北醫藥學院附屬醫院，湖北 十堰 442000）

中風是世界上第二大常見死亡原因和導致殘疾的主要原因，缺血性卒中的治療方法仍然是當前腦血管研究的關鍵領域之一［1-3］。在缺血后的一段時間內，再灌注對缺血性腦造成嚴重損害，導致嚴重的腦微循環障礙甚至神經元損傷，這與缺血性卒中后的殘疾和死亡率密切相關［4-6］。沉默交配型信息調節2同源物1（SIRT1）是NAD+依賴性酶的Sirtuin家族的關鍵成員，其與氧化應激反應有關，SIRT1可直接通過磷酸化和去乙酰化的活性影響過氧化物酶體增殖物激活受體-c共激活劑-1（PGC-1）［7-8］。上調PGC-1α可通過減輕氧化應激來減少神經元死亡。多項研究表明，SIRT1、PGC-1信號通路的激活可發揮抗腦局灶性腦缺血再灌注損傷的作用，SIRT1、PGC-1可通過磷酸化后滅活促凋亡蛋白［9］。芪蝎活血通絡湯具有活絡除濕、化瘀止痛的功效［10］，本研究擬探討芪蝎活血通絡湯對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的神經保護作用及SIRT1、PGC-1表達的影響，為局灶性腦缺血再灌注損傷的治療提供理論及臨床依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠100只，8周齡；體質量280～300 g；河北省實驗動物中心（證書號907048）提供，大鼠圈養在環境控制的繁殖室（溫度22～24℃；濕度50%～55%；12 h黑暗/12 h光照循環）中，自由獲取標準實驗室食物和水。

1.2 試藥與儀器 芪蝎活血通絡湯組方為：黃芪120 g，全蝎20 g，川芎、當歸、赤芍、桃仁及地龍各15 g，雞血藤及丹參各30 g，紅花及甘草各10 g。水煎300 mL，濃縮至50 mL。根據成人與大鼠劑量公式換算，以10.0 mL/kg體質量灌胃，將藥液配制成為10.0 g/mL。TRIzol Reagent（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）；大鼠 SIRT1（＃Rn00567167_mL），大鼠PGC-1（#Rn00492539_mL），大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（＃Rn01775763_g1）的TaqMan基因表達分析購自Applied Biosystems（Foster City，CA，USA）。兔多克隆抗 SIRT1、PGC-1抗體（抗 SIRT1；目錄號BA0565-1；抗PGC-1；目錄號BA0890；1∶50，來自武漢博士特生物技術有限公司）；多克隆山羊抗兔IgG/鏈霉抗生物素蛋白抗體；Ori-Gene Technologies，Inc，Beijing，China；SIRT1、PGC-13試劑盒（SIRT1目錄號SXM026、PGC-13目錄號SX01165，上海森雄生物科技產業有限公司）；二氨基聯苯胺試劑盒（DAB，目錄號AR1022，武漢博士德生物技術有限公司）。分光光度計SmartSpec 3000（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。

1.3 造模與分組 根據體質量隨機分成5組：對照組、模型組、芪蝎活血通絡湯低劑量組（2.0 mg/kg）、芪蝎活血通絡湯中劑量組（4.0 mg/kg）、芪蝎活血通絡湯高劑量組（8.0 mg/kg），每組20只，雌雄各半。模型組、芪蝎活血通絡湯各劑量組腔注射戊巴比妥腹麻醉后，通過頸中線切口分離左頸總動脈（CCA）和頸內動脈（ICA）。將預先涂有硅橡膠（外徑0.26 mm）的尼龍單絲插入CCA并進入ICA至左側CCA分叉處約19～20 mm以閉塞大腦中動脈。然后，在誘導缺血后2 h，緩慢取出皮膚并將動物放回籠中再灌注22 h。對照組的大鼠只切開皮膚和分離血管，不進行阻塞血流。在整個外科手術過程中，使用紅外燈將大鼠體溫維持在37℃。術后給予20萬U青霉素肌肉注射，連續使用3 d。

1.4 給藥方法 芪蝎活血通絡湯各劑量組術后第1天開始腹腔給予相應劑量藥物，對照組和模型組給予等體積0.9%氯化鈉溶液，持續給予4周。

1.5 神經功能缺損評分 以盲控方式記錄缺血性損傷后7、14 d每只大鼠的神經功能缺損評分。

1.6 貼紙去除及平衡木行走實驗［11-12］采用2片10 mm的正方形黏性紙粘住大鼠2個前肢掌面，記錄大鼠去除兩側紙片的總時間為雙側貼紙去除時間。105 cm×4 cm×3 cm的平衡木離地80 cm，起始點為陡峭平臺，終點為一平臺，記錄大鼠通過整個平衡木的時間為平衡木過桿時間。

1.7 大鼠海馬組織中SIRT1、PGC-1 mRNA水平測定 取大鼠海馬組織于1 mL TRIzol Reagent中勻漿。加入0.2 mL氯仿后，將混合物在4℃下以12000 g離心15 min。將水相轉移到新管中，加入0.5 mL異丙醇。在4℃下以10000 g離心10 min后，用1 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀物，并在4℃下以7500 g離心5 min。然后將RNA沉淀物風干并溶解在不含RNase的水中。為了測定RNA濃度，使用分光光度計SmartSpec 3000測量260 nm處的吸光度。使用TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit和StepOnePlus實時PCR系統進行RTPCR。

1.8 SIRT1、PGC-1蛋白在大鼠海馬組織的表達水平測定 取大鼠海馬組織石蠟包埋切片用于檢測SIRT1、PGC-1的表達。將切片脫蠟，用分級的醇系列再水化并用PBS洗滌。然后將切片在室溫下在3%H2O2中溫育10 min以淬滅內源性過氧化物酶活性并在PBS中漂洗。將切片與兔多克隆抗SIRT1、PGC-1抗體一起孵育。然后在PBS中在37℃下保持2 h。然后將切片與生物素標記的二抗在37℃下孵育30 min。在兩個高倍顯微鏡下評估每個切片中皮質和海馬SIRT1、PGC-1的表達水平。ELISA測定大鼠海馬組織中SIRT1、PGC-1蛋白水平。

1.9 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析或t檢驗比較，多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經運動功能評分比較 見表1。與對照組比較，模型組缺血損傷后7、14 d神經功能缺損評分明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，芪蝎活血通絡湯各劑量組7、14 d神經功能缺損評分降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經運動功能評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經運動功能評分比較（分，±s）

與對照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同

組別對照組模型組芪蝎活血通絡湯低劑量組芪蝎活血通絡湯中劑量組芪蝎活血通絡湯高劑量組n 20202020207 d 0±010.66±0.47*8.14±0.34*△6.23±0.23*△5.35±0.16*△14 d 0±08.75±0.37*5.35±0.31*△4.91±0.26*△3.51±0.30*△

2.2 各組大鼠雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間比較 見表2。與對照組比較，模型組雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，芪蝎活血通絡湯各劑量組雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間比較（s，±s）

表2 各組大鼠雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間比較（s，±s）

組別對照組模型組芪蝎活血通絡湯低劑量組芪蝎活血通絡湯中劑量組芪蝎活血通絡湯高劑量組n 2020202020雙側貼紙去除時間26.34±6.87103.63±25.65*80.76±8.12*△51.28±9.88*△50.32±9.16*△平衡木過桿時間1.99±0.3416.54±6.87*12.30±0.51*△8.65±0.51*△4.71±0.50*△

2.3 各組大鼠海馬神經元結構的影響 見圖1。對照組海馬區神經元細胞完整，結構正常，染色清晰，核呈卵圓形位于中央。模型組海馬區可見大量壞死神經元，且細胞脫失現象明顯，細胞核固縮。芪蝎活血通絡湯高劑量組海馬區見少量壞死神經元細胞，且神經元細胞結構較為完整，神經元細胞核呈卵圓形位于中央，分布均勻。芪蝎活血通絡湯中、低劑量組較模型組而言，壞死神經元細胞減少，但神經元細胞疏松紊亂，細胞核固縮，脫失現象明顯，具有明顯的劑量依賴效應。

圖1 各組大鼠海馬神經元結構（HE染色，400倍）

2.4 各組大鼠SIRT1、PGC-1 mRNA表達水平比較見表3。與對照組比較，模型組SIRT1、PGC-1 mRNA水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，芪蝎活血通絡湯各劑量組SIRT1、PGC-1 mRNA水平升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠SIRT1、PGC-1 mRNA表達水平比較（±s）

表3 各組大鼠SIRT1、PGC-1 mRNA表達水平比較（±s）

組別對照組模型組芪蝎活血通絡湯低劑量組芪蝎活血通絡湯中劑量組芪蝎活血通絡湯高劑量組n 2020202020 SIRT11.94±0.110.56±0.13*0.91±0.18*△1.49±0.20*△1.78±0.11*△PGC-11.76±0.170.98±0.12*1.57±0.17*△1.09±0.17*△1.12±0.16△

2.5 各組大鼠SIRT1、PGC-1蛋白表達水平比較 見表4，圖2～圖3。與對照組組比較，模型組SIRT1、PGC-1蛋白水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，芪蝎活血通絡湯各劑量組SIRT1、PGC-1蛋白水平升高（P＜0.05）。免疫組化法下，SIRT1、PGC-1陽性表達為棕褐色，各組SIRT1、PGC-1陽性表達情況與各蛋白表達水平符合。

圖2 各組大鼠腦缺血再灌注損傷SIRT1表達（DAB，400倍）

圖3 各組大鼠腦缺血再灌注損傷PGC-1表達（DAB，400倍）

3 討 論

芪蝎活血通絡湯具有多重生物活性，包括鎮痛，擴張血管，降低血漿黏度，抑制血小板聚集，抗血栓和增強抗缺氧能力等。研究證明，芪蝎活血通絡湯含有黃酮類化合物，其具有抗腦缺血的神經保護作用［13］。研究結果顯示，芪蝎活血通絡湯各劑量組7、14 d神經功能缺損評分、雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間降低，且隨著芪蝎活血通絡湯給藥劑量的增加，7、14 d神經功能缺損評分、雙側貼紙去除時間、平衡木過桿時間逐漸降低，結合病理學結果芪蝎活血通絡湯高劑量組海馬區見少量壞死神經元細胞，且神經元細胞結構較為完整，神經元細胞核呈卵圓形位于中央，分布均勻；芪蝎活血通絡湯中、低劑量組較模型組而言，壞死神經元細胞減少，但經元疏松紊亂，細胞核固縮，脫失現象明顯，具有明顯的劑量依賴效應。這說明，芪蝎活血通絡湯能明顯減輕局灶性腦缺血再灌注損傷程度，具有神經保護作用。

表4 各組大鼠SIRT1、PGC-1蛋白表達水平比較（ng/g，±s）

表4 各組大鼠SIRT1、PGC-1蛋白表達水平比較（ng/g，±s）

組別對照組模型組芪蝎活血通絡湯低劑量組芪蝎活血通絡湯中劑量組芪蝎活血通絡湯高劑量組n 2020202020 SIRT1183.67±15.6371.14±16.78103.73±13.65*△123.17±99.69*△152.58±13.74*△PGC-1145.77±6.4667.86±6.98139.58±8.9789.45±6.98*△120.15±10.69△

SIRT1最近被發現是一類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性的去乙酰化蛋白酶，其在長壽和應激反應中起關鍵作用［14］。在缺血再灌注神經損傷中，SIRT1活性的抑制與腦缺血和再灌注誘導的神經元死亡有關。然而，改善SIRT1活性有助于缺血性腦的抗細胞凋亡和神經保護作用。研究已經證實Akt的乙酰化（Ser473）是SIRT1完全啟動其激活所必需的［15］。通過激酶和PH結構域之間的分子內相互作用，SIRT1通常維持在無活性狀態，而Akt的PH結構域和3種乙酰基肌苷之間的相互作用使得乙酰經歷重要的構象變化，這使得激活物能夠接近激活環并且乙酰化Akt中Thr308的位點［16］。疏水基序中Ser473的乙酰化是Akt最大活化的先決條件。SIRT1的過表達激活了PGC-1對細胞存活以及線粒體活性的轉錄活性。SIRT1直接使蛋白質的不同結構域中的PGC-1去乙酰化，形成控制代謝基因表達的轉錄復合物。以這種方式，產生更多的能量。近期研究表明，PGC-1是調節內網應激效應介導的細胞凋亡的保護主要因素。PGC-1位于內質網的細胞質中，能被內網應激效應激活，此外過量的Ca2+水平以及內質網中大量蛋白沉淀均可激活PGC-1，PGC-1可直接抑制Caspasc-3和Caspasc-7的活性，來阻斷各種刺激誘導的細胞凋亡過程；此外，PGC-1也可通過P21間接抑制Caspase；PGC-1與細胞周期調控因子CDK4結合，導致CDK2/cyclin-E激活和核糖體（Rb）磷酸化，Rb磷酸化后啟動細胞進入周期，加快G1/S期的轉換進而阻斷凋亡信號轉導通路［17-19］。本次研究結果顯示，與對照組比較，模型組SIRT1、PGC-1 mRNA及蛋白水平降低；與模型組比較，芪蝎活血通絡湯各劑量組SIRT1、PGC-1 mRNA及蛋白水平升高。這提示芪蝎活血通絡湯能促進SIRT1、PGC-1 mRNA及蛋白的表達，進而對神經元細胞產生保護作用。

綜上所述，芪蝎活血通絡湯能明顯減輕局灶性腦缺血再灌注損傷程度，具有神經保護作用；其機制與蝎活血通絡湯能促進SIRT1、PGC-1 mRNA及蛋白的表達有關。