威柏膏外敷治療對急性痛風性關節炎大鼠滑膜組織NALP-3炎性體的調控研究?

李 揚 任開明 左新河 姜 楠

（1.湖北省中醫院，湖北 武漢 430061；2.武漢大學人民醫院，湖北 武漢 430060）

世界各地痛風患病率逐年增加，2015年的綜述報告顯示痛風的患病率升至1%～4%，年發病率約為2.6‰，在西方，男性發病率約為3%～6%，女性約為1%～2%，在毛利族人中甚至高達10%［1］。隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，我國痛風的發病率也在上升，其中以臺灣地區居民居高，2010年的調查研究顯示其患病率為6.24%［2］。高嘌呤飲食、酒精攝入、肥胖是痛風的重要致病因素，痛風常常與2型糖尿病、高血壓病、高脂血癥以及心腦血管疾病相伴發［3］。

目前臨床上控制痛風急性發作的藥物主要有秋水仙堿、非甾體抗炎藥、糖皮質激素等藥物，但這些藥物所帶來的胃腸道不良反應以及對中樞神經系統、肝臟、造血系統的損害不容忽視，尤其對于老年患者，往往由于存在全身多個器官系統疾病，對這些藥物的耐受力更低。本文通信作者任開明教授長期致力于痛風性關節炎的中醫中藥研究，遵循中醫外病外治的思路，根據多年臨床經驗研制出治療急性痛風的外敷膏劑——威柏膏（由威靈仙等8味中藥組成），通過局部用藥直接緩解痛風性關節炎急性發作期癥狀，減輕炎癥反應，以期達到療效佳、不良反應少的治療目的。

本課題組前期的研究結果［4］發現，威柏膏能顯著減輕大鼠急性痛風性關節炎的炎性反應，下調關節滑膜組織中重要炎性介質白細胞介素-1β（IL-1β）的表達。既往研究表明，IL-1β的成熟和釋放依賴于NALP-3炎性體［5-6］，本實驗擬進一步研究威柏膏外敷治療對NALP-3炎性體表達的影響，試圖從更深層面來解釋威柏膏治療急性痛風性關節炎的作用機理，為威柏膏臨床應用提供有力依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 32只雄性SPF級Wistar大鼠，體質量180～220 g，由湖北省實驗動物研究中心提供，動物合格證號SYXK（鄂）2015-0018。SPF動物實驗室適應性喂養1周。

1.2 試藥與儀器 威柏膏：由威靈仙、黃柏等8味中藥制成膏劑，武漢大學人民醫院藥事部制。秋水仙堿片（西雙版納版納藥業有限公司生產，規格0.5 mg），以1 mg︰100 mL注射用水比例配制成0.01 mg/mL濃度溶液。尿酸鈉溶液（25 mg/mL），配制方法同前期研究［4］。尿酸鈉晶體參考 Coderre經典法［4，7］配制：194 mL 蒸餾水加6 mL 1 mol/L NaOH，煮沸，加1 g尿酸，用1 mol/L HCL調pH至7.2，攪拌冷卻，-4℃冰箱保存24 h，去上清，用濾紙將沉淀物水分吸干，放入70℃干燥箱烘2 h，取出，刮下粉末，放入研缽內研成細末，用孔徑250 μm的金屬篩過篩，高溫高壓滅菌以去除內毒素，裝瓶備用。取500 mg尿酸鈉晶體加18 mL 0.9%氯化鈉注射液，再加2 mL吐溫80，加熱攪拌，配制成20mL尿酸鈉溶液。NALP-3一抗（HPA012878，Sigma）、Caspase-1（BM4291，Boster）一抗，SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。HVE-50型高壓消毒鍋，Hirayama，USA；HMIAS-2000W高清晰彩色醫學圖文分析系統，武漢千屏；石蠟組織切片機，Leica Germany；普通光學顯微鏡、顯微照相機，Olympus Japan。

1.3 分組與造模 適應性喂養1周后，32只大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、威柏膏組、秋水仙堿組4個組，每組8只。急性痛風性關節炎大鼠模型建立：按Coderre經典方法略做改進，實驗動物各組用10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉，然后消毒踝關節周圍皮膚，用1 mL注射針在受試大鼠右側踝關節背側45°方向插入脛骨肌腱內側，正常對照組注入0.25 mL 0.9%氯化鈉注射液；模型對照組、威柏膏組、秋水仙堿組均將0.25 mL尿酸鈉溶液注入踝關節腔［7］。給藥方法：威柏膏組于造模后1 h即開始用威柏膏外敷于受試關節，每日2次；秋水仙堿組用秋水仙堿溶液灌胃，0.15 mg/kg，每日3次。各組給藥均為3 d。

1.4 標本采集與檢測 造模后步態評分、關節腫脹度測量，方法同前期研究［4］。造模后1 h開始觀察大鼠步態，并在24、48、72 h 3個時間點進行評分。步態評分標準如下：0分為正常步態，雙足均勻著地；1分為足著地減輕，足趾未展開，輕度跛行；2分為足屈起，趾背著地，明顯跛行；3分為足完全離地，三足步態。關節腫脹度=造模后關節周徑測量值—造模前關節周徑測量值。標本取材、固定、脫鈣、切片流程如下：各組大鼠于造模及用藥78 h后處死，無菌條件下取各組大鼠受試踝關節上下0.5 cm之間的組織，去掉皮膚，分別放入含有固定液（4%多聚甲醛）的50 mL無菌量杯中，置-4℃冰箱保存24 h。用10%EDTA脫鈣10周后石蠟包埋，切成5 μm薄片。關節組織切片HE染色，光鏡下觀察滑膜病理改變。免疫組化法檢測踝關節滑膜組織中NALP-3、Caspase-1的相對表達量。具體步驟為：脫蠟后3%過氧化氫液封閉過氧化物酶，血清封閉，再分別加抗大鼠NALP-3、Caspase-1的一抗，按SABC試劑盒標準步驟操作，最后經DAB溶液顯色。陰性對照除了用PBS代替一抗外，所有步驟相同，以有棕黃色顆粒沉著為陽性細胞。每張玻片隨機選擇20個視野（×200），用HMIAS-2000千屏高清彩色醫學圖文分析系統進行吸光度測量并自動轉換為A（吸光度）值，每個標本的NALP-3、Caspase-1相對表達含量用20個視野的平均A值表示。

1.5 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠步態觀察結果比較 見表1。造模后1 h，各組大鼠步態均不正常：正常對照組大鼠輕度跛行；其余3組大鼠足屈起，趾背著地，明顯跛行或呈三足步態。造模24 h后可見：正常對照組大鼠步態恢復正常，其余3組大鼠仍明顯跛行。隨時間推移，與模型對照組比較，威柏膏組及秋水仙堿組評分差異有統計學意義（P＜0.05）。威柏膏組較秋水仙堿組恢復快（P＜0.05）。

表1 各組大鼠步態評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠步態評分比較（分，±s）

與正常對照組比較，?P＜0.05；與模型對照組比較，△P＜0.05；與秋水仙堿組比較，▲P＜0.05。下同

組別n 1 h 24 h 48 h 72 h正常對照組模型對照組威柏膏組秋水仙堿組8 8 8 80.625±0.1712.250±0.233*1.875±0.117△1.875±0.211△02.875±0.117*2.250±0.153△2.375±0.238△02.250±0.153*1.500±0.177△▲1.875±0.113△02.000±0.005*1.375±0.171△▲1.625±0.246△

2.2 各組大鼠關節腫脹度動態測量結果比較 見表2。造模后1 h，各組大鼠踝關節處均腫脹，正常對照組大鼠輕度紅腫，模型對照組、威柏膏組、秋水仙堿組踝關節處均明顯紅腫。造模24 h后觀察可見：正常對照組大鼠關節外觀恢復正常，模型對照組、威柏膏組、秋水仙堿組大鼠踝關節仍然嚴重紅腫。隨時間推移，與模型對照組比較，威柏膏組及秋水仙堿組，腫脹度下降明顯（P＜0.05）。威柏膏組較秋水仙堿組下降更明顯（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠滑膜病理觀察結果 見圖1。正常對照組大鼠關節滑膜組織偶見炎性細胞浸潤，滑膜組織厚度正常，未見增生。模型對照組大鼠滑膜組織可見大量中性粒細胞、巨噬細胞浸潤，毛細血管擴張、充血。與模型對照組比較，威柏膏組炎性細胞浸潤明顯減少。

表2 各組大鼠關節腫脹度比較（cm，±s）

表2 各組大鼠關節腫脹度比較（cm，±s）

組別正常對照組模型對照組威柏膏組秋水仙堿組n 8 8 8 81 h 0.28±0.0410.73±0.104*0.62±0.089△0.65±0.094△24 h 0.17±0.0250.78±0.111*0.71±0.101△0.72±0.103△48 h 0.14±0.0200.65±0.092*0.29±0.042△▲0.44±0.063△72 h 0.06±0.0120.61±0.087*0.11±0.015△▲0.28±0.040△

圖1 各組大鼠滑膜組織觀察（HE染色，200倍）

2.4 各組大鼠關節滑膜組織中NALP-3、Caspase-1相對表達含量比較 見圖2～圖3，表3。與正常對照組比較，模型對照組踝關節滑膜組織中NALP-3、Caspase-1相對表達含量明顯增加（P＜0.05）；與模型對照組比較，威柏膏組、秋水仙堿組滑膜組織中NALP-3、Caspase-1相對表達含量顯著減低（P＜0.05），威柏膏組與秋水仙堿組之間無明顯差異（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠踝關節滑膜組織NALP-3的表達（免疫組化染色，200倍）

圖3 各組大鼠踝關節滑膜組織Caspase-1的表達（免疫組化染色，200倍）

表3 各組大鼠關節滑膜組織NALP-3、Caspase-1相對表達含量（±s）

表3 各組大鼠關節滑膜組織NALP-3、Caspase-1相對表達含量（±s）

組別正常對照組模型對照組威柏膏組秋水仙堿組n8888 NALP-30.1323±0.01650.2012±0.0245*0.1751±0.0218△0.1685±0.0175△Caspase-10.1389±0.01950.2162±0.0285*0.1652±0.0163△0.1725±0.0115△

3 討 論

中醫理論認為痛風發生的主要原因在于先天稟賦不足、脾腎功能失調，濕熱之邪痹阻于肢體、經絡，氣血運行失暢所致，與遺傳、體質、飲食、外感、環境等因素有關。急性痛風性關節炎多表現為風濕熱痹，治法以清熱除濕、通絡止痛為主。據中藥典籍《唐本草》《海上集驗方》《藥品化義》《廣西中草藥》等記載，威靈仙具有祛風濕、通經絡、止痹痛、消骨鯁等功效。本文通信作者任開明教授課題組多年來以威靈仙為核心，研究其對痛風性腎病、痛風性關節炎的作用，實驗研究已經發現威靈仙能顯著減少尿酸性腎病模型大鼠尿酸鹽結晶在腎小管間質的沉積，從而保護腎小管間質［8］，抑制了腎小管和腎間質的上皮細胞表型轉化及下調NF-κB的表達［9］。在臨床研究中同樣證實威靈仙、草決明復方膠囊能降低血尿酸及血脂、改善腎功能、減少蛋白尿［10］。在此基礎上，任開明教授遵循中醫外病外治的治則，根據多年臨床經驗研制出治療急性痛風性關節炎的外敷膏劑——威柏膏，此方由威靈仙配伍黃柏、蒼術、乳香、沒藥等8味中藥而成，其中威靈仙祛風除濕、促進尿酸溶解；黃柏、蒼術燥濕清熱；乳香、沒藥、當歸活血調氣止痛；五加皮祛風濕、利筋骨；冰片促進透皮吸收，引藥直達痛風炎癥部位，全方共奏清熱祛濕、活血止痛之功效。本課題組前期的動物實驗研究［4］發現，該方能顯著減輕急性痛風性關節炎模型大鼠的關節腫脹度，減少滑膜組織炎性細胞浸潤，并能顯著降低受試關節滑膜組織中IL-1β的表達。

急性痛風性關節炎是由于嘌呤代謝紊亂使血尿酸水平升高，尿酸鈉鹽結晶沉積于關節腔內，引起白細胞趨化、吞噬，從而形成了關節紅腫熱痛的急性炎癥反應［11］。IL-1β是介導痛風性關節炎的重要炎癥因子，在中性粒細胞趨化、激活過程中起重要作用［12-13］。Martinon等［5-6］研究提示IL-1β的成熟和釋放依賴于NALP-3炎性體（NACHT-LRR-PYD結構域蛋白3），NALP-3炎性體介導了急性痛風的發生發展過程。NALP-3炎性體是一類分子量約為700 kDa的大分子蛋白復合體，在細胞質內發揮外源性微生物或內源性信號感受器的作用，是活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1）的分子平臺，直接調控著IL-1β、IL-18、IL-33等促炎細胞因子的成熟和分泌，在天然免疫、獲得性免疫反應中發揮重要作用［14-15］。NALP-3炎性體主要由3個部分組成：核苷酸結合寡聚化結構域樣受體（NLRs）家族成員NALP-3、銜接蛋白ASC，以及效應蛋白Caspase-1［16］。NALP-3是其中的核心蛋白，功能是將下游的銜接蛋白ASC和效應分子Caspase-1前體（Pro-caspase-1）連接起來。NALP-3炎性體完成組裝后，使Pro-caspase-1自動催化成Caspase-1，后者又稱IL-1β轉化酶，進一步將無活性IL-1β前體剪切為成熟的IL-1β［17］。

根據上述機理，在前期研究基礎上，本實驗進一步研究了威柏膏對急性痛風性關節炎模型大鼠關節滑膜中NALP-3炎性體的調控作用，實驗結果發現威柏膏可以顯著降低滑膜組織中NALP-3炎性體的核心蛋白NALP-3及效應分子Caspase-1的表達含量，從而有效減少其下游IL-1β前體向成熟IL-1β的轉化，最終減輕關節滑膜炎癥反應，提示威柏膏對急性痛風關節滑膜中NALP-3/Caspase-1/IL-1β通路的調控是其治療作用的核心環節。本實驗結果為威柏膏的臨床應用提供了較為有力的分子機制依據。

現有的治療痛風急性發作的常用藥物為秋水仙堿，但其毒副作用十分明顯；常用外用藥主要為非甾體抗炎藥，如扶他林等，可以緩解輕、中度疼痛，但無法解決痛風發作的根本問題，還有抑制軟骨的合成的不良反應，并能破壞軟骨細胞［18］。本實驗中對急性痛風模型大鼠步態與關節腫脹度的觀察發現，威柏膏對急性痛風性關節炎止痛效果優于秋水仙堿組，充分說明中藥外治法治療急性痛風性關節炎的優勢，威柏膏可以從病因層面調節痛風受累關節滑膜組織的炎性反應，其方法簡單易行，便于患者使用，并可避免口服藥物的諸多不良反應，因此擁有廣闊的臨床應用前景。