益氣活血方對慢性心力衰竭大鼠心肌IP3R mRNA、mi-CK mRNA表達水平的影響

朱 波 楊 艷 蘇仁意 許細平 孫乾朕 闕新祥

（1.湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院，湖北 襄陽 441000；2.長江大學仙桃臨床醫學院，湖北 仙桃 433000）

慢性心力衰竭（CHF）是各種心血管系統疾病發展的終末期表現，其發生過程有各種因素參與，臨床表現復雜，預后較差，對人們生命健康造成了嚴重的威脅［1-2］。相關文獻報道，益氣活血方藥具有益氣活血、溫陽利水的作用，而且能改善血流動力學指標和心肌能量代謝，增強心肌收縮力和改善心功能［3-4］。心肌線粒體肌酸激酶（mi-CK）是磷酸肌酸激酶（CK）同工酶家族成員，與三磷酸腺苷（ATP）再生有關。三磷酸肌醇受體（IP3R）能與內質網重要的伴侶蛋白Sigma-1受體（Sigma-1R）相互作用從而調控心血管系統功能。為此，本研究建立心肌梗死后心力衰竭大鼠模型，探討該方抗心力衰竭的機制，為臨床治療提供依據。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年健康Wistar大鼠90只，雄性，12周齡，體質量（210±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0001，1周適應性喂養，自由飲水。

1.2 實驗藥物 益氣活血復方提取浸膏干粉（黃芪、丹參、人參、益母草、三七粉、茯苓、葶藶子，此組方每克干粉相當于生藥2.86 g），襄陽市第一人民醫院提供。賴諾普利片由國藥集團汕頭金石制藥有限公司生產，每片5 mg；國藥準字：H20065767。

1.3 試劑及儀器 mi-CK免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；羊抗兔IgG、mi-CK抗體（北京中杉生物技術有限公司）；基因擴增儀Gene Amp PCR system 9700（美國應用生物系統公司）；SONOS5500彩色多普勒超聲機（美國安捷倫科技有限公司）；BS-51顯微鏡（日本Olympus公司）。引物均由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 模型制備 采用10%水合氯醛腹腔麻醉（0.5～0.8 mL/100 g），大鼠背位固定，經喉氣管插管術，連接呼吸機，以50～55次/min，潮氣量0.7～0.8 mL進行人工呼吸。在左胸第3～4肋間橫向切開皮膚，長度大概1.5 cm，鈍性分離肌層，接著沿3～4肋間隙打開胸腔，暴露心臟，撕開心包，輕提左心耳，在動脈左主干起源點2～4 mm處用6號縫線結扎（正常組只穿線，不結扎），隨后立即重置心臟于胸腔，逐層縫合。術后連續7 d注射青霉素鈉，預防感染，常規飼養。術后第5周行EF檢測，心電圖顯示左室射血分數EF值≤40%則表示心衰造模成功。

1.5 分組與給藥 剔除死亡以及不符合心衰標準的大鼠。造模成功的大鼠隨機分為模型組、西藥組、中藥組，未左冠脈結扎手術只穿線的假手術大鼠納入正常組。每組各15只大鼠。術后第5周正常組及模型組灌服等容積蒸餾水，每日1次。根據換算公式，給藥劑量（g/kg）=人的劑量（g）×0.018/所求動物體質量（kg）。中藥組予以4.6 g生藥量（kg·d）的益氣活血方藥物；西藥組予以1.5 mg生藥（kg·d）的賴諾普利片，各組連續給藥4周。

1.6 標本采集與檢測 1）血流動力學檢測。將連續給藥（蒸餾水）結束后的大鼠，以10%水合氯醛0.5～0.8 mL/100 g腹腔麻醉，背位固定于鼠板，應用心臟Doppler檢測左室壓力變化最大速率（±dp/dtmax）。2）心肌組織IP3R mRNA、mi-CK mRNA的檢測。處死大鼠，取心臟心肌組織，分成2份，裝入凍存管，并于液氮中冷凍后，-80℃冰箱保存，待測。采用實時定量熒光PCR法檢測IP3R mRNA、mi-CK mRNA表達：取出標本后，用Trizol法提取總RNA，計算總RNA的濃度和純度。取2 μg總RNA，按照說明書配制20 μL反應體系，進行反轉錄。PCR擴增IP3R、mi-CK，并擴增β-actin。以cDNA為模板，擴增出208 bp的DNA序列。IP3R的序列如下。上游引物：5′CATTTGCCGACTCTGCTACA3′。下游引物：5′TGTGCTTTTCCAGGAGCT TT3′。mi-CK的序列：上游引物：5′AGATGCCAGTAA AATCCGTTCTG3′。下游引物：5′TTCGGCCAGTTCTGACTCTAGAG3′。內參對照物β-actin的序列：上游引物：5′AGATCCTGACCGAGCGTGGC3′。下游引物：5′CCAGGGAGGAAGAGGATGCG3′。擴增條件為：95 ℃10 min預變性，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸20 s，40個循環。灌制瓊脂糖凝膠，取10 μL PCR產物進行電泳鑒定。紫外分光光度計檢測，應用凝膠掃描成像系統分析PCR產物條帶。

1.7 統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，兩兩比較用LSD法。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組左室壓力變化最大速率比較 見表1。本次研究結果中，與正常組比較，各治療組±dp/dtmax明顯升高，模型組明顯下降（P＜0.05）；與各治療組比較，模型組±dp/dtmax明顯下降（P＜0.05）；與西藥組比較，中藥組±dp/dtmax明顯升高（P＜0.05）。

圖1 IP3R、mi-CK、β-actin擴增片段電泳圖

2.2 各組IP3R mRNA、mi-CK mRNA水平比較 見表2。如表2所示，與正常組比較，中藥組和模型組IP3RmRNA表達明顯增加，模型組mi-CK mRNA表達明顯降低（P＜0.05），正常組與西藥組在IP3R mRNA、mi-CK mRNA表達上比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與各治療組比較，模型組IP3R mRNA表達明顯增加，mi-CK mRNA表達下降（P＜0.05）；與西藥組比較，中藥組IP3R mRNA表達明顯增加（P＜0.05）；西藥組mi-CK mRNA表達高于中藥組，但比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組左室壓力變化最大速率比較（mmHg/s，±s）

表1 各組左室壓力變化最大速率比較（mmHg/s，±s）

與正常組比較，?P＜0.05；與各治療組比較，△P＜0.05；與西藥組比較，#P＜0.05。下同

-dp/dtmax 4908.63±100.71*#4716.41±109.24*5024.11±108.723101.54±116.18△組別中藥組西藥組正常組模型組n 15151515+dp/dtmax 5643.19±195.13*#5212.67±171.07*4816.63±160.323256.22±180.54*△

表2 各組IP3R mRNA、mi-CK mRNA水平比較（2-△△Ct，±s）

表2 各組IP3R mRNA、mi-CK mRNA水平比較（2-△△Ct，±s）

組別n IP3R mRNA mi-CK mRNA 15151515中藥組西藥組正常組模型組1.15±0.13*#1.03±0.071.02±0.141.52±0.47*△1.69±0.991.71±0.781.90±0.981.29±0.69*△

3 討論

本次實驗采用冠脈結扎法制備心衰大鼠模型，模擬臨床上較為常見的缺血性心衰，是目前成熟且公認的心衰模型，與心肌梗死所致的心力衰竭的病理生理變化相似。并且針對氣虛血瘀這一病機，選用中藥益氣活血復方灌胃，方中黃芪可補氣固表，托毒排膿；丹參具有活血祛瘀，通經止痛的作用；人參有補脾益肺、生津之功效；益母草可活血調經、清熱解毒；三七粉止血、散瘀；茯苓健脾、寧心；葶藶子具有利水消腫、泄熱逐邪的作用，諸藥共奏益氣活血、通絡化瘀之效［5-6］。近年來研究發現，益氣活血方藥能夠抑制或逆轉心室重構，緩解心力衰竭。本研究結果顯示，模型組±dp/dtmax明顯低于正常組，說明模型組大鼠心功能下降，符合心衰癥狀。經治療，各藥物組±dp/dtmax明顯高于模型組，提示應用藥物后，西藥及益氣活血中藥都能夠延緩心功能轉向失代償期的進程，減輕心功能惡化。與西藥組比較，中藥組±dp/dtmax明顯升高，提示益氣活血方具有增強心肌收縮力的作用。

心臟主要由大量的ATP維持收縮功能以及磷酸肌酸（PCr）儲備能量［7-8］。然而ATP本身含量相對少，CK作為肌酸激酶能量穿梭系統的關鍵酶，其穿梭系統調控ATP與PCr間的能量轉換［9-10］。當發生CHF，會損傷肌酸激酶穿梭系統功能，mi-CK與CK受抑，影響ATP轉運穿梭效率，進而使得心肌收縮功能障礙。本研究結果顯示，模型組心衰大鼠心肌mi-CK mRNA明顯低于正常組。經治療，各用藥組大鼠mi-CK mRNA及蛋白有所上升，且明顯高于模型組，但西藥組與中藥組比較差異無統計學意義，說明中西醫治療均可以上調mi-CK mRNA水平，改善ATP轉運穿梭效率，增加細胞內能量流，增強心肌收縮力，減緩心衰惡化的進程。

相關文獻認為，IP3R與Sigma-1R相互作用會對Ca2+-ATP酶活性造成間接影響［11-13］。在Sigma-1R抑制劑的作用下，會削弱Sigma-1R與IP3R形成復合體，抑制Ca2+從內質網向線粒體轉運，而且誘導內質網內Ca2+釋放至胞質，以至于減少線粒體ATP，造成心功能惡化［14-15］。本研究結果顯示，與正常組比較，中藥組和模型組IP3R mRNA表達明顯增加；與各治療組比較，模型組mi-CK mRNA表達下降，比較差異具有統計學意義；與西藥組比較，中藥組IP3R mRNA表達明顯增加，比較差異具有統計學意義。結果說明益氣活血方可能通過抑制IP3R mRNA，進一步調控內質網及線粒體間Ca2+信號轉導改善亞細胞器損傷，改善心肌能量代謝。考慮到亞細胞器間信號轉導結構較為復雜，關于IP3R在保護心肌細胞上的作用仍需進一步探討其分子機制，為治療CHF提供科學依據。

綜上所述，益氣活血復方可降低心衰大鼠心肌IP3R mRNA表達，增加mi-CK mRNA表達，改善亞細胞器損傷和ATP轉運穿梭效率，改善心肌的舒縮功能，減緩心衰惡化的進程。