細胞因子在結(jié)核早期診斷中的動力學(xué)評價

宋青山，賈芳，黃海榮

（1.內(nèi)蒙古河套學(xué)院，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院，北京 101149）

0 引言

結(jié)核病仍是當今全球面臨的主要公共衛(wèi)生問題之一，全世界每年都有新增成為活動性的結(jié)核。目前，大約有三分之一的人口感染了結(jié)核分枝桿菌，其中有大部分為潛伏性結(jié)核感染，還有部分在沒有細菌學(xué)檢測的情況下直接按照結(jié)核病治療[1]。結(jié)核病患者大多數(shù)來自發(fā)展中國家，且結(jié)核病又是慢性病，治療結(jié)核病的時間較長和金錢花銷較多。若能有簡單、快速敏感性高的檢測結(jié)核病的方法將會給人類帶來極大的好處。結(jié)核病預(yù)后取決于抗結(jié)核治療的早晚，不同時期的結(jié)核病人其療效、預(yù)后截然不同，故結(jié)核病的早期、快速、準確診斷對于早期化療和控制傳播都至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 病例的納入

2016 年10 月至2017 年8 月來自昌平醫(yī)院結(jié)防所初治結(jié)核病人43 例。所有納入病例都簽署書面知情同意書，所有痰涂片陽性和痰涂片陰性的患者都被診斷為患有結(jié)核病。由醫(yī)院工作人員連續(xù)登記。回顧性地將患者分為三組，一組為涂片陽性，培養(yǎng)陽性的病例（記為S+C+）；二組為涂片陰性，培養(yǎng)陽性的病例（記為S-C+），三組為涂片陰性，培養(yǎng)陰性的病例（記為S-C-）。

1.2 血清收集

在開始抗結(jié)核治療前(第0 天)和治療一周之后（7 天后）采集血樣。血液樣品(2-5 mL)在無抗凝劑的空泡管中采集后，在室溫下靜置30-60 min，然后將樣品在1500 rpm 下離心15 min 后吸取上清分裝凍存在-80 ℃。

1.3 細胞因子動態(tài)變化測定方法

選擇已報道的與結(jié)核病免疫應(yīng)答密切相關(guān)的細胞 因 子IP-10、IL-10、IL-27、MCP-1、sIL-2 R、INF-γ、TNF-α、IL-12、IL-4、IL-6 ELISA 試 劑盒（購自BlueGene），嚴格按照產(chǎn)品說明書進行操作。選擇酶標儀在450 nm 波長下讀取（OD）結(jié)果。每孔設(shè)置三個重復(fù)孔，求平均OD 值。數(shù)據(jù)分析用ELISACalc 軟件以O(shè)D 值為Y 軸，以細胞因子濃度為X 軸做4 參數(shù)回歸標準曲線，然后計算出樣品OD 值所對應(yīng)的細胞因子濃度。

1.4 統(tǒng)計分析

用統(tǒng)計分析軟件SPSS 20.0 進行數(shù)理統(tǒng)計分析，多組完全隨機計量資料用Mann-Whitney U、Kruskal-Wilcoxon 秩和檢驗，樣本間兩兩用Nemenyi 秩和檢驗。并繪制ROC 曲線以評價試驗的敏感性和特異性。

2 結(jié)果

2.1 病人納入情況

病人在確診為結(jié)核病時，在服藥之前要進行肝功能的檢測，這時我們采集到的是病人治療前(第0天)的血清，治療一周之后（7 天后）再檢測肝功能，這時我們采集到的是病人治療7 天后的血清。病人首先要滿足醫(yī)院檢查的血量需要，因此血量有限，難以滿足所檢查的細胞因子用相同病人的血樣，又由于是回顧性的研究，例數(shù)也不盡一樣（詳細所選例數(shù)見表1）。

表1 各種細胞因子病人納入的人數(shù)

2.2 Logistic 標準曲線擬合

以O(shè)D 值為Y 軸，以細胞因子濃度為X 軸做4 參數(shù)回歸標準曲線，以IFN-α 為例（見圖1）。曲線方程：y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D。

A=1.62840，B=1.08438，C=272.59575，D=0.00256，r2=0.99849

圖1 lFN-α 標準曲線

2.3 細胞因子動態(tài)變化情況

2.3.1 S+C+、S-C+、S-C-三組細胞因子血清含量均值變化

用Mann-WhitneyU 檢驗比較S+C+、S-C+、S-C-各組治 療 前 后IP-10、IL-10、IL-27、MCP-1、sIL-2 R、INF-γ、TNF-α、IL-12、IL-4、IL-6 血清含量均值發(fā)現(xiàn)，這些細胞因子治療前和治療后無統(tǒng)計學(xué) 意 義（U=49，P=0.94）。Kruskal-Wilcoxon檢驗比較S+C+、S-C+、S-C-三組治療前之間無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.56，P=0.76）及三組治療后之間無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.24，P=0.89），從圖2 中可以看出S+C+、S-C+、S-C-三組治療前后細胞因子含量比較，在S+C+組中，治療前到治療后IP-10、IL-27、TNF-α、IL-4 是升高了，而其它的細胞因子降低了。在S-C+組中，只有IP-10 和IL-4 是升高了，而其它的細胞因子降低了。在S-C-組中，TNF-α 和sIL-2R是升高了，而其它的細胞因子降低了。

2.3.2 S+C+、S-C+、S-C-三組各細胞因子動態(tài)變化

三組各細胞因子變化數(shù)目見表2，IP-10 在治療前S+C+、S-C+、S-C-三組血清含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.28），治療7 天后IP-10 血清含量變化如圖3A，在S+C+中，有2 個是增加，有2 個是減少；在S-C+中有4 個增加，8 個減少；在S-C-中，有17個增加，11 個減少。

IL-27 在 治 療 前S+C+、S-C+、S-C-三組血清含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.196），治療7 天后IL-27 血清含量變化如圖3B，在S+C+中，有4 個是增加，有2 個是減少；在S-C+中有7 個增加，3 個減少；在S-C-中，有13 個增加，14 個減少。

MCP-10 在治療前S+C+、S-C+、S-C-三組血清含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.559），治療7 天后MCP-10 血清含量變化如圖3C，在S+C+中，有2 個是增加，有3 個是減少；在S-C+中有5 個增加，7個減少；在S-C-中，有5 個增加，21 個減少。

IL-10 在治療前S+C+、S-C+、S-C-三組血清含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.67），治療7 天后IL-10 血清含量變化如圖3D，在S+C+中，有2 個是增加，有3 個是減少；在S-C+中有3 個增加，5個減少；在S-C-中，有8 個增加，9 個減少。

TNF-α 在治療前S+C+、S-C+、S-C-三組血清含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.054），治療7 天后IP-10 血清含量變化如圖3E，在S+C+中，有2 個是增加，有1 個是減少；在S-C+中有5 個增加，4 個減少；在S-C-中，有6 個增加，8 個減少。

sIL-2R 在 治 療 前S+C+、S-C+、S-C-三 組 血 清含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.36），治療7 天后sIL-2R 血清含量變化如圖3F，在S+C+中，有1 個是增加，有3 個是減少；在S-C+中有3 個增加，8個減少；在S-C-中，有8 個增加，13 個減少。

IL-12 在治療前S+C+、S-C+、S-C-三組血清含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.57），治療7 天后IL-12 血清含量變化如圖3G，在S+C+中，有1 個是增加，有2 個是減少；在S-C+中有3 個增加，3個減少；在S-C-中，有10 個增加，0 個減少。

INF-γ 在治療前S+C+、S-C+、S-C-三組血清含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.13），治療7 天后INF-γ 血清含量變化如圖3H，在S+C+中，有3 個是增加，有0 個是減少；在S-C+中有4 個增加，2個減少；在S-C-中，有2 個增加，8 個減少。

IL-6 在治療前S+C+、S-C+、S-C-三組血清含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.89），治療7 天后IL-6 血清含量變化如圖3I，在S+C+中，有1 個是增加，有2個是減少；在S-C+中有2 個增加，4 個減少；在S-C-中，有1 個增加，9 個減少。

IL-4 在治療前S+C+、S-C+、S-C-三組血清含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.156），治療7 天后IL-4 血清含量變化如圖3 J，在S+C+中，有1 個是增加，有0 個是減少；在S-C+中有1 個增加，1 個減少；在S-C-中，有1 個增加，5 個減少。

表2 1 S+C+、S-C+、S-C-三組各細胞因子動態(tài)變化數(shù)目

圖2 S+C+、S-C+、S-C-三組治療前后細胞因子含量比較

圖3 （A-J）S+C+、S-C+、S-C-各細胞因子動態(tài)變化曲線

2.4 ROC 曲線檢驗細胞因子與S+C+、S-C+、S-C-的相關(guān)性

得到ROC 曲線，證明細胞因子在治療的第0 天至第7 天之間的變化，以確定細胞因子作為結(jié)核病診斷的評價因子。對于IP-10,在S+C+、S-C+、S-C-之間 ROC 曲線下面積為0.33 [95 % CI 0.14-0.58]，P＞0.05。對于IP-10 治療前后的變化，ROC 曲線下面積為0.54[95 % CI 0.13-0.95]，P＞0.05。

3 討論

盡管新技術(shù)的發(fā)展，痰涂片陰性結(jié)核病患者的診斷仍然是一個臨床挑戰(zhàn)，近幾十年的體外檢測結(jié)核病試驗使得將近一半的病人接受了臨床懷疑，中低水平收入的結(jié)核病患者在沒有細菌學(xué)證實下接受了結(jié)核病治療[2]。因此，這些患者中有許多人可能沒有患結(jié)核病，而且長時間暴露在不必要的環(huán)境中使用抗結(jié)核藥物進行治療。因此，迫切需要開發(fā)新的確診結(jié)核病診斷工具應(yīng)用于臨床診斷。

我們試圖想去發(fā)現(xiàn)一個細胞因子能夠表現(xiàn)出來特別的診斷優(yōu)勢，于是對IP-10、IL-10、IL-27、MCP-1、sIL-2R、INF-γ、TNF-α、IL-12、IL-4、IL-6 10 個細胞因子做出評價，但是令人遺憾的是結(jié)果并不像我們想象的那樣，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)10個細胞因子在S+C+、S-C+、S-C-三組并沒有統(tǒng)計學(xué)意義，也就是說這10 個細胞因子在結(jié)核菌培養(yǎng)陽性、涂片陽性、培養(yǎng)陰性、涂片陰性之間沒有明確的區(qū)別。10 個細胞因子中，每個細胞因子血清含量均值在治療前和治療后無統(tǒng)計學(xué)意義。說明這10 個細胞因子在治療前(第0 天)和治療一周之后（7 天）沒有統(tǒng)計的變化規(guī)律。這次評價與大多數(shù)患者的IP-10基線都有所增加濃度[3]，IP-10 血清水平以前被發(fā)現(xiàn)在病人中升高結(jié)核病[4-6]結(jié)果存在不相一致性。

但是值得我們注意的是我們看到了每個人每個細胞因子在治療前后是有變化的（表2 和圖3）。盡管這些變化有增有減沒有規(guī)律可循。這些就會提醒我們今后去尋找他們變化的原因。是其它的疾病影響到了這些細胞因子的變化[7,8]，還是臨床治療方案影響到了他們的變化，還是患者本身感染的結(jié)核分枝桿菌存在差異，如有的是敏感的結(jié)核分枝桿菌，有的則是MDR 或XDR。我們也試圖想發(fā)現(xiàn)患者在治療過程中耐藥性的轉(zhuǎn)化于細胞因子的相關(guān)性，在隨后的隨訪中發(fā)現(xiàn)，我們研究的患者經(jīng)過抗結(jié)核病的治療都出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，只有1 例效果不明顯轉(zhuǎn)為耐藥菌株，由于病例太少只發(fā)現(xiàn)IP-10、IL-27、sIL-2 R 的變化，沒有找到變化規(guī)律。