一種呼吸道口咽菌群系統(tǒng)分類和快速鑒定的方法

李新鳴，孫冶，孫躍嶺，王哲，張松，崔楠，肖純凌*

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院和平院區(qū)檢驗(yàn)科）

盡管相對(duì)于腸道微生態(tài)，對(duì)于呼吸道微生態(tài)研究較少，但呼吸道菌群仍然是決定呼吸道健康與否的決定性因素［1-2］。由于大氣污染日益嚴(yán)重，呼吸道感染發(fā)病率有增高趨勢(shì)，尤其是對(duì)兒童和老年人致死率高，而成為全球關(guān)注的問題［3-6］。以往認(rèn)為呼吸道感染僅僅是由致病菌造成的，隨著科學(xué)技術(shù)手段的進(jìn)步，現(xiàn)在認(rèn)為呼吸道菌群與呼吸道健康狀況密切相關(guān)［7］。當(dāng)前我國城市大氣污染形勢(shì)嚴(yán)峻，大氣污染對(duì)呼吸道菌群產(chǎn)生影響，菌群構(gòu)成發(fā)生改變。如何有效、迅速地評(píng)定受檢者呼吸道菌群的狀態(tài)至關(guān)重要。本研究建立了一種呼吸道口咽菌群系統(tǒng)分類和快速鑒定的方法，這種方法可以簡便、迅速地分析口咽菌群構(gòu)成，為有效評(píng)定口咽菌群的健康狀態(tài)提供直接依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 呼吸道菌群的采集和菌懸液制備 取108例志愿者（男54例，女54例，年齡18～22周歲）口咽咽拭標(biāo)本：用一次性無菌長棉簽（揚(yáng)州洋生醫(yī)藥科技有限公司）刮取志愿者咽部后，立即放入裝有1 ml的腦心浸液（北京索萊寶科技有限公司）+5%胎牛血清（北京索萊寶科技有限公司）的細(xì)菌培養(yǎng)管中，渦旋劇烈震蕩30 s后，將獲得的菌懸液室溫靜置30 min。

1.2 不同濃度的菌懸液制備 將菌懸液分別稀釋至1、10、100及500倍。步驟：將靜置好的菌懸液（1倍）再次渦旋劇烈震蕩30 s，移液器吸取100 μl菌懸液加入到900 μl的腦心浸液+5%胎牛血清中，渦旋劇烈震蕩30 s，此時(shí)菌懸液濃度稀釋至10倍；移液器吸取100 μl稀釋10倍的菌懸液加入到900 μl的腦心浸液+5%胎牛血清中，渦旋劇烈震蕩30 s，此時(shí)菌懸液濃度稀釋至100倍；移液器吸取100 μl稀釋100倍的菌懸液加入到400 μl的腦心浸液+5%胎牛血清中，渦旋劇烈震蕩30 s，此時(shí)菌懸液濃度稀釋至500倍，冰上靜置備用。

1.3 呼吸道菌群的分離培養(yǎng) 分別用移液器吸取 100 μl稀釋 1倍、10倍、100倍、500倍的菌懸液，加入到血固體培養(yǎng)基（含有5%無菌脫脂羊血（北京索萊寶科技有限公司）營養(yǎng)瓊脂）和巧克力固體培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司），用無菌不銹鋼涂布棒（上海生工生物工程有限公司）均勻涂布，直至有生澀感。分別用移液器吸取100 μl稀釋1倍、10倍、100倍的菌懸液，加入到厭氧固體培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司），用無菌不銹鋼涂布棒均勻涂布。分別用移液器吸取100 μl稀釋1倍、10倍的菌懸液，加入到麥康凱固體培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、沙保弱固體培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），用無菌不銹鋼涂布棒均勻涂布。將血固體培養(yǎng)基、麥康凱固體培養(yǎng)基及沙保弱固體培養(yǎng)基置于37℃溫箱培養(yǎng)，將巧克力固體培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)，將厭氧固體培養(yǎng)基置于厭氧培養(yǎng)盒中，37℃溫箱培養(yǎng)。

1.4 呼吸道菌群的系統(tǒng)分類和計(jì)數(shù) 當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為24 h時(shí)，取出血固體培養(yǎng)基、巧克力固體培養(yǎng)基及麥康凱固體培養(yǎng)基，分別對(duì)1倍和10倍稀釋菌懸液培養(yǎng)物菌落特征進(jìn)行觀察及計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)中大型菌落數(shù)量和描述菌落形態(tài)特征及判定溶血性；對(duì)100倍稀釋培養(yǎng)物，計(jì)數(shù)小菌落、針尖狀菌落數(shù)量并描述菌落形態(tài)特征；對(duì)500倍稀釋培養(yǎng)物，通過可見光源照射到固體培養(yǎng)基上，計(jì)數(shù)針尖狀菌落數(shù)量和描述菌落形態(tài)特征及溶血性。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)，取出厭氧固體培養(yǎng)基，對(duì)1倍和10倍稀釋菌懸液培養(yǎng)物，分別計(jì)數(shù)中大型菌落數(shù)量和描述菌落形態(tài)特征；對(duì)100倍稀釋培養(yǎng)物，計(jì)數(shù)小菌落、針尖狀菌落數(shù)量和描述菌落形態(tài)特征。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為120 h時(shí)，取出沙保弱固體培養(yǎng)基，分別對(duì)1倍、10倍稀釋培養(yǎng)物，計(jì)數(shù)真菌的數(shù)量和描述菌落的形態(tài)特征［8-9］。

1.5 菌株的16S rDNA擴(kuò)增和鑒定 挑取單菌落溶解于 20 μl的 0.1%Triton-100的 EP管中，100℃沸水煮5 min。按照PCR反應(yīng)試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司，R176，25 μl的反應(yīng)體系）說明書，擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA片段。反應(yīng)成分 ：Pre mix 12.5 μl）、Forward Primer 0.25 μl、Reverse Primer 0.25 μl、ddH2O 8 μl、模板DNA 4 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1.5 min，共30個(gè)循環(huán)，最終擴(kuò)增片段約1.1 kb。PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海生工生物公司完成。

2 結(jié)果

2.1 呼吸道菌群在不同培養(yǎng)基上菌落特征的分類 呼吸道口咽菌群在不同的選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，每種選擇性培養(yǎng)出的菌落種類及菌落形態(tài)特征見表1。

2.2 呼吸道菌群16S rDNA序列擴(kuò)增結(jié)果 按照表1所示菌落特征，挑取血固體培養(yǎng)基、巧克力固體培養(yǎng)基、麥康凱固體培養(yǎng)基及厭氧固體培養(yǎng)基生長的不同類型菌落，通過快速菌落PCR擴(kuò)增出16S rDNA特異性片段，經(jīng)上海生工生物公司完成測(cè)序。菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

圖1 呼吸道菌群16S rDNA片段擴(kuò)增結(jié)果

2.3 呼吸道菌群16S rDNA測(cè)序與菌株鑒定 將16S rDNA測(cè)序結(jié)果，與NCBI基因序列庫比對(duì)，從眾多的細(xì)菌序列比對(duì)結(jié)果中選出相似性（Similarity）＞95%的結(jié)果即可認(rèn)為是同一種菌，獲得菌株在種級(jí)別上的鑒定結(jié)果。部分結(jié)果見表2。

表1 呼吸道菌群在不同培養(yǎng)基上菌落特征的分類

表2 呼吸道菌群部分測(cè)序結(jié)果

3 討論

人體口咽與外界相通，是空氣、食物通過的共同部位，也是病原菌侵入下呼吸道和肺部并引起感染的必經(jīng)部位。口咽部定植的微生物構(gòu)成種類、數(shù)量是相對(duì)恒定的［7，10-11］。Xiao 等［12-13］提出了呼吸道微生態(tài)變化是大氣污染亞臨床損害的早期效應(yīng)，而口咽固有定植菌中的甲型鏈球菌群改變，可以作為呼吸系統(tǒng)早期損害效應(yīng)的指示菌。

傳統(tǒng)的細(xì)菌分類方法，通常將混合菌液分布在平板上，根據(jù)細(xì)菌菌落的形態(tài)、鏡下細(xì)菌的形態(tài)及革蘭染色等來判斷細(xì)菌基本的生物學(xué)特性，然后，根據(jù)這些特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一些生理生化試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)及毒性試驗(yàn)最終鑒定出菌株。傳統(tǒng)方法工作量大，能源消耗大，鑒定出來的結(jié)果往往到細(xì)菌的屬，而進(jìn)一步鑒定到種或者是亞種很難。本研究依據(jù)108例健康人群口咽菌群分離培養(yǎng)結(jié)果，對(duì)4種細(xì)菌培養(yǎng)基和1種真菌培養(yǎng)基上生長的27種特征菌落進(jìn)行了分類。首次對(duì)可常規(guī)分離培養(yǎng)獲得的口咽菌群菌落特征進(jìn)行了詳盡準(zhǔn)確的歸納，對(duì)于后續(xù)口咽菌群中細(xì)菌菌株的鑒定及系統(tǒng)分類提供了基礎(chǔ)。在傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法基礎(chǔ)上，有效地結(jié)合新興的16S rDNA分子生物學(xué)技術(shù)，利用菌落PCR特異性擴(kuò)增特征菌落的16S rDNA片段并測(cè)序分析鑒定細(xì)菌，建立了細(xì)菌菌株快速、準(zhǔn)確的鑒定方法。目前，傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定方法，仍然是最通用的方法，其主要依靠細(xì)菌分離培養(yǎng)、染色及大量生化反應(yīng)鑒定，整個(gè)程序耗時(shí)長，對(duì)于細(xì)菌在種這一級(jí)的鑒定缺乏準(zhǔn)確性［14-15］。本研究所建立的鑒定方法克服了傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定方法的不足，能在3～5 d內(nèi)對(duì)特異性的細(xì)菌的屬、種及株作出明確鑒定。因此，可以快速、準(zhǔn)確地顯示口咽菌群中重要定植菌群的構(gòu)成。

我國大氣污染狀況面臨長期持續(xù)存在，大氣污染直接呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生影響，開展呼吸系統(tǒng)菌群研究至關(guān)重要［16-17］。建立簡便、有效的呼吸道菌群分離及鑒定方法，及時(shí)準(zhǔn)確地反映呼吸道健康狀態(tài)是關(guān)鍵。本研究所建立的口咽菌群系統(tǒng)分類和快速鑒定的方法，有助于開展呼吸道菌群的實(shí)時(shí)檢測(cè)，指示呼吸道狀況。