燕窩提取物的抗氧化及促進表皮細胞生長活性比較

董建輝，田巧基,2，段素芳,2，劉義鳳,2，李海枝,2，夏凱,2*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司，北京，100015)2(功能主食創制與慢病干預北京市重點實驗室，北京，100015)

近年來，膳食結構改變導致糖尿病、脂肪肝、心血管疾病等慢病發病率在全球不斷攀升[1]。臨床研究顯示，慢病的發生與氧化應激有密不可分的聯系，氧化應激導致的肺纖維化造成了肺組織順應性減退，彌散功能降低，最終導致患者出現難治性呼吸困難，嚴重危害人類生命健康[2-6]。因此調節氧化應激水平具有降低疾病發生風險和管理疾病的重要作用[7]。

燕窩作為一種歷史悠久的保健食材，美容養顏、潤肺生津[8-9]。早在唐朝，燕窩已深受宮廷貴族的青睞，現代研究表明，燕窩中豐富的生物活性成分葡萄糖胺、乳鐵蛋白、唾液酸、氨基酸、脂肪酸、維生素、礦物質和抗氧化劑等具有抗炎、抗氧化及強化骨骼的作用[8,10-14]。更有研究證明，燕窩提取物可通過調節肝臟抗氧化和炎癥相關基因的轉錄，對高脂飲食誘導的氧化應激和炎癥有一定的抑制作用[15-17]。

皮膚創傷修復的基本方式是通過傷后再生的細胞和細胞間質填充、連接或代替損傷組織，因此細胞增生是創傷修復的重要過程[18]。皮膚衰老是由于表皮角質形成對細胞生長和更新速度減慢，膠原和彈性纖維合成能力下降，表皮和真皮變薄導致皮膚拉伸后彈性恢復力減弱。因此，在皮膚松弛、皮膚損傷修復、抗老化過程中，表皮角質形成細胞的生長、分化至關重要。燕窩中的活性成分具有促表皮角質形成細胞生長的能力。但是傳統燕窩的加工一般采用高溫燉煮的方式，往往伴隨燕窩中的有效成分熱損失，采用低溫鮮燉加工工藝生產的“95°鮮燕窩”，可使細胞中的活性成分得到有效保留。H2O2是一種強氧化劑，易于穿透細胞膜，與胞內Fe3+反應形成自由基，導致胞內脂質、蛋白質及DNA損傷[19-21]。本研究選取H2O2誘導MRC-5細胞氧化應激損傷模型比較傳統工藝制作的燕窩與“95°鮮燕窩”的抗氧化能力；并通過Hacat細胞初步探究了2種燕窩提取提取物物及燕窩肽促進皮膚角質細胞(Hacat)生長能力的差別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRC-5細胞、Hacat細胞，購自中國醫學科學院基礎醫學研究所；傳統工藝加工燕窩，實驗室制備；“95°鮮燕窩”、燕窩肽，玖拾五度鮮生物科技有限公司提供；MEM(modified eagle medium)培養基、MEM(含NEAA)培養基、平衡鹽緩沖液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)，中科邁晨科技有限公司；胎牛牛血清(fetal bovine serum，FBS)，美國Gibco；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒、2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)，胰蛋白酶，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒，碧云天生物技術研究所。

1.2 儀器與設備

生物安全柜，濟南鑫貝西生物技術有限公司；CO2培養箱，松下公司；倒置生物顯微鏡(CKX41)，奧林巴斯公司；分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；pH計，上海雷磁儀器廠；Spectra Max酶標儀(i3)，MD公司；超聲波清洗儀(KQ-250DE)，昆山超聲儀器有限公司；高速冷凍離心機(GL-20G-Ⅱ型)，上海安亭科學儀器廠；冷凍干燥機，北京松源華興科技發展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品提取

分別取75 g “95°鮮燕窩”和傳統燕窩加入適量的水混勻后剪切10 min，于高速冷凍離心機7 500 r/min，4 ℃條件下離心10 min，取上清于50 mL離心管中，放入冷凍干燥機進行凍干，凍干后回收樣品水提物進行下一步實驗。

1.3.2 細胞的體外培養

1.3.2.1 MRC-5細胞的培養

MRC-5細胞培養于含有10%FBS、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 U/mL的MEM培養基中，于37 ℃、含5%CO2以及90%相對濕度的培養箱中常規培養。當細胞生長至對數生長期時進行實驗。

1.3.2.2 Hacat細胞的培養

Hacat細胞培養于含有10%FBS、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 U/mL的MEM(NESS)培養基中。培養條件同1.3.2.1。

1.3.3 MRC-5氧化應激細胞模型的構建

1.3.3.1 H2O2的CCK-8細胞毒理學實驗

取96孔培養板，每孔加100 μL細胞懸液，細胞濃度為1×105個/mL，37 ℃培養24 h后棄去培養液，用HBSS清洗一次，每孔加入50、100、150、200、250、300、400、500 μmol/L 8個不同濃度H2O2100 μL，以無H2O2的相同培養基孵育細胞為對照，培養24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液于37 ℃避光孵育2 h。用酶標儀在450 nm處測定吸光度。以對照組細胞的細胞存活率為100%計算其余組別細胞存活率。

1.3.3.2 氧化應激細胞模型的構建

選取對細胞生長無顯著影響的H2O2濃度誘導氧化應激細胞模型，各組細胞加樣處理24 h后，小心棄去培養液，用HBSS洗1次，用RIPA裂解液裂解30 min后，按試劑盒說明書步驟測定細胞內SOD、GSH-PX水平。各組細胞加樣處理24 h后，小心棄去培養液，HBSS洗1次，加入25 μmol的DCFH-DA作用30 min，吸出DCFH-DA用HBSS洗2次，每孔加入300 μL胰酶消化5 min后，用700 μL完全培養基終止消化，吹打均勻后用流式細胞儀測定熒光強度。結果以模型組ROS含量的百分比表示(%)。

1.3.4 燕窩水提物及燕窩肽對MRC-5細胞氧化應激損傷的預保護作用

1.3.4.1 燕窩水提物及燕窩肽的CCK-8細胞毒理學實驗

分別選取200、400、500、600、800、1 000 μg/mL 5個不同濃度的燕窩水提物及燕窩肽測定3種樣品對MRC-5細胞增殖的影響，實驗方法同1.3.3.1。

1.3.4.2 實驗分組

在建立的氧化應激細胞模型的基礎上觀察兩種燕窩水提物及燕窩肽對氧化應激損傷細胞產生的預保護作用。

將細胞以3.5×106個/mL的濃度接種于96孔板，待細胞貼壁并長滿時，用HBSS潤洗細胞一次，加入不同的處理液。細胞分組為對照組：純培養基、模型組：300 μmol/L H2O2組以及模型組中提前加入各燕窩水提物孵育2 h的實驗組(終濃度200～400 μg/mL)。細胞上樣前用HBSS緩沖液洗1次，上樣后37 ℃孵育24 h，測定各組的SOD、ROS、MDA、GSH-PX，測定方法同1.3.3.2。

1.3.5 燕窩水提物及燕窩肽對Hacat細胞增殖的影響

分別選取10、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL 8個不同濃度的燕窩水提物及燕窩肽測定3種樣品對Hacat細胞增殖的影響，實驗方法同1.3.3.1。

1.3.6 統計學處理

2 結果與分析

2.1 MRC-5氧化應激細胞模型的構建

2.1.1 H2O2對MRC-5細胞增殖的影響

如圖1所示，由于H2O2對細胞具有一定的損傷作用，隨著H2O2濃度的增加細胞存活率顯著下降。當H2O2濃度達到250 μmol/L顯著抑制細胞生長(P<0.05)，H2O2達到400 μmol/L時，對細胞的抑制率大于50%，嚴重影響細胞的生長繁殖。因此后續誘導氧化應激模型實驗中選擇上樣濃度為100、150、200、250、300 μmol/L。

圖1 不同濃度H2O2對MRC-5細胞活力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of H2O2 on the viability of MRC-5 cells注：*P<0.05(相對于對照組)。下同。

2.1.2 氧化應激細胞模型的構建

ROS是氧化應激的主要標志物之一，產生氧化應激損傷的主要原因是體內生成的ROS超出了機體生理范圍量。ROS持續高濃度存在，會導致肺纖維化、動脈粥樣硬化等疾病的發生。由圖2可知，H2O2處理24 h后，低濃度的H2O2會引起細胞內ROS含量降低，這說明當細胞內氧化應激水平較低時，能夠通過自身的抗氧化能力降低ROS含量，減輕氧化應激對細胞帶來的損傷，但是隨著H2O2濃度不斷升高導致氧化應激水平較高時，ROS含量就會超出自身調節的范圍就會并對細胞造成傷害。

圖2 H2O2處理對MRC-5細胞內ROS的影響Fig.2 Effect of H2O2 treatment on ROS content in MRC-5 Cells

SOD是機體抗氧化的主要酶類之一，SOD活力也是判定化合物抗氧化能力的指標之一。由圖3可知，H2O2處理24 h后，SOD活力呈先增加后降低的趨勢，這種趨勢與ROS的結果相一致，細胞出現輕度的氧化應激時，能夠增加SOD的酶活力來緩解氧化應激，從而減低對細胞帶來的損傷，但是當氧化應激超出自身調節的范圍時就會抑制SOD的酶活力，此時不斷增多的ROS對細胞造成損傷。

圖3 H2O2處理對MRC-5細胞內SOD活力的影響Fig.3 Effect of H2O2 treatment on SOD activity in MRC-5 Cells

綜上所述，當H2O2達到300 μmol/L時，ROS含量顯著增加(P<0.05)，SOD含量降低證明細胞出現氧化應激損傷，因此選擇300 μmol/L H2O2為最終造模濃度。

2.2 燕窩水提物及燕窩肽對MRC-5細胞氧化應激損傷的預保護作用

2.2.1 燕窩水提物及燕窩肽對MRC-5細胞增殖的影響

由圖4可知，低濃度(600 μg/mL以下)的“95°鮮燕窩”水提物及燕窩肽促進細胞生長，高濃度(800 μg/mL以上)“95°鮮燕窩”水提物及傳統燕窩提取物抑制細胞生長。綜合上述實驗結果，3種樣品在200～400 μg/mL不影響MRC-5細胞生長活力，因此選擇此濃度范圍進行后續的預保護實驗。

2.2.2 燕窩水提物及燕窩肽對MRC-5細胞氧化應激損傷的預保護作用

由圖5可知，與對照組相比模型組ROS含量顯著增加(P<0.05)，表明MRC-5細胞出現了氧化應激損傷。與模型組相比，“95°鮮燕窩”水提物和燕窩肽在200～400 μg/mL預處理2h能顯著降低ROS含量(P<0.05)，且隨著濃度的增加呈劑量依賴性降低胞內ROS含量。傳統燕窩水提物在200 μg/mL對ROS含量無顯著影響，在300、400 μg/mL時呈劑量依賴性顯著降低ROS含量(P<0.05)。實驗結果表明3種樣品均能顯著降低ROS含量，“95°鮮燕窩”水提物在低濃度時能夠發揮較好的ROS清除能力。

MDA是細胞膜脂質過氧化最重要的產物之一，它的生成表明細胞出現氧化應激損傷。由圖6可知，與對照組相比模型組MDA含量顯著增加(P<0.05)，表明模型組出現氧化應激。與模型組相比，“95°鮮燕窩”水提物在400 μmol/L預處理2 h顯著降低MDA含量(P<0.05)，燕窩肽在300 μmol/L預處理2 h顯著降低MDA含量(P<0.05)。因此，“95°鮮燕窩”、燕窩肽能有效清除胞內MDA，減輕細胞的氧化應激損傷，傳統燕窩水提物對MDA含量沒有顯著影響。

圖4 不同濃度燕窩及燕窩肽對MRC-5細胞活力的影響Fig.4 Effects of different concentrations of bird's nest extract and bird′s nest peptide on the viability of Mrc-5 cells

圖5 燕窩水提物及燕窩肽對MRC-5細胞內ROS的影響Fig.5 Effects of bird's nest extract and bird′s nest peptide on ROS content in MRC-5 cells注：燕窩提取物及燕窩肽對MRC-5細胞內ROS的影響 #P<0.05 vs對照組，*P<0.05 vs模型組

圖6 燕窩水提物及燕窩肽對MRC-5細胞MDA含量的影響Fig.6 Effects of bird′s nest extract and bird′s nest peptide on MDA content in MRC-5 cells

由圖7可知，與對照組相比模型組SOD活力顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，“95°鮮燕窩”水提物和燕窩肽在300、400 μmol/L預處理2 h能顯著增加SOD酶活力(P<0.05)，傳統燕窩水提物在400 μmol/L顯著增加SOD酶活力(P<0.05)。細胞內SOD酶活力增加，表明細胞清除ROS、調節氧化應激的能力增強。因此兩種燕窩水提物及燕窩肽均能通過增加SOD酶活力改善氧化應激，且與傳統燕窩水提物相比“95°鮮燕窩”水提物處理組增加SOD酶活力的能力更強，能更有效地改善氧化應激損傷。

圖7 燕窩水提物及燕窩肽對MRC-5細胞內SOD活力的影響Fig.7 Effects of bird′s nest extract and bird′s nest peptide on SOD activity in MRC-5 cells

GSH-PX是除SOD以外的另一類抗氧化酶，其活力能間接反應機體的氧化應激水平同時也可以判斷化合物的抗氧化能力。由圖8可知，與對照組相比模型組GSH-PX活力顯著降低(P<0.05)，“95°鮮燕窩”水提物在400 μmol/L預處理2 h，與模型組相比能顯著增加GSH-PX活力(P<0.05)，因此，“95°燕窩”水提物能通過增加GSH-PX活力減輕細胞的氧化應激損傷。傳統燕窩水提物與燕窩肽均能不同程度地增強GSH-PX活力但是與模型組相比無顯著性。

圖8 燕窩水提物及燕窩肽對MRC-5細胞GSH-PX活力的影響Fig.8 Effects of bird′s nest extract and bird′s nest peptide on the activity of GSH-PX in MRC-5 cells

肺是人體重要的呼吸器官，由于某些原因導致的肺損傷，使機體的氧化/抗氧化系統失衡，最終引發機體氧化應激反應，進而產生氧化損傷，導致細胞死亡及組織損傷，促進機體內成纖維細胞趨化[22]。通過研究肺纖維化動物模型發現氧化應激水平顯著增高，相應的抗氧化物明顯減少，表示氧化/抗氧化失衡可能在肺維化發病機制中發揮重要作用[2,9]。本研究通過細胞實驗證明，“95°鮮燕窩”水提物通過顯著增加SOD、GSH-PX酶活力(P<0.05)，進而降低細胞ROS、MDA等氧化應激標志物的生成。傳統燕窩水提物能夠增加SOD酶活力，降低ROS含量；燕窩肽能夠增加SOD酶活力，降低胞內ROS、MDA的含量。

2.3 燕窩水提物及燕窩肽對Hacat細胞增殖的影響

表皮角質形成細胞的生長、分化對皮膚損傷修復、抗老化至關重要[23]。圖9所示，不同濃度燕窩水提物及燕窩肽處理細胞24 h后對細胞增殖的影響，傳統燕窩水提物在100μmol/mL時顯著刺激細胞生長(P<0.05)，大于300 μmol/mL時顯著抑制細胞生長(P<0.05)。“95°鮮燕窩”在200μmol/mL時顯著刺激細胞生長(P<0.05)，燕窩肽在100 μmol/mL時顯著刺激細胞生長(P<0.05)。

圖9 不同濃度燕窩水提物及燕窩肽對Hacat細胞活力的影響Fig.9 Effects of different concentrations of bird′s nest extract and bird′s nest peptide on the viability of Hacat cells

如圖10所示，200 μmol/mL的“95°鮮燕窩”水提物顯著刺激Hacat細胞增殖，培養24 h后，細胞密度大于傳統燕窩水提物及燕窩肽組。因此，“95°鮮燕窩”在200 μmol/mL時顯著刺激Hacat的生長分化(P<0.05)，說明其在皮膚損傷及抗衰老的過程中具有一定的功效。

3 結論與展望

研究通過氧化應激細胞模型實驗證實，燕窩及燕窩肽能夠通過增加SOD、GSH-PX酶活力，進而降低胞內ROS、MDA水平改善細胞氧化應激狀態并且這種保護作用存在劑量效應關系，尤其是“95°鮮燕窩”水提物及燕窩肽作用效果顯著，由此推測燕窩的加工方式對其活性成分具有一定的影響。同時燕窩水提物均表現出促進Hacat細胞的增殖作用，表明燕窩中的有效成分在抵抗皮膚松弛、皮膚損傷修復、抗老化過程中發揮作用。本研究僅在細胞水平上對燕窩的生理功能進行了初步探索，由于細胞實驗本身具有一定的局限性，因此后續還需要進一步的體內實驗進行驗證。近年來大量研究數據表明慢病發生常伴隨氧化應激出現，因此深入探究燕窩活性成分的抗氧化機制對于慢病防治具有深遠的意義。

a-對照組;b-傳統燕窩水提物組;c-“95°鮮燕窩”水提物組;d-燕窩肽組圖10 燕窩水提物及燕窩肽(200 μmol/mL)對Hacat細胞活力的影響Fig.10 Effects of bird′s nest extract and bird′s nest peptide (200 μmol/mL)on the viability of Hacat cells