趨化因子與SP-D在持續(xù)性慢性鼻炎發(fā)病中的作用機制研究

馬鵬，馮俊，彭濤

(川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院·南充市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，四川 南充 637000)

慢性鼻炎為耳鼻喉科的常見病、多發(fā)病，但其病因至今仍未完全明確。近年來，對該病發(fā)病機制的研究多認為是多因素、多基因、多信號途徑共同作用的結果[1]。肺表面活性蛋白D(surfactant protein D，SP-D)表達于肺部下呼吸道，肺特異性較為顯著，其參與了肺組織局部免疫，能夠維持肺泡表面的穩(wěn)定性。目前，越來越多的研究[2]發(fā)現，SP-D能夠下調炎癥因子，在炎癥發(fā)生過程中起著重要的作用。趨化因子白介素16(interleukin 16，IL-16)作為一種炎癥細胞因子，可參與機體炎癥反應的發(fā)生發(fā)展。另有研究[3]表明，SP-D、IL-16在鼻炎伴鼻息肉患者的鼻竇黏膜中呈高表達，但其與持續(xù)性慢性鼻炎的關系卻尚未明確。本研究采用免疫組織化學方法(SP法)檢測持續(xù)性慢性鼻炎患者的鼻粘膜組織中SP-D及IL-16的表達及分布情況，借以探究其在持續(xù)性慢性鼻炎發(fā)病中的作用及意義。

1 資料和方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選擇2016年10月至2017年10月在南充市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科住院的單純鼻中隔偏曲患者(對照組)和鼻中隔偏曲伴持續(xù)性慢性鼻炎患者(研究組)各30例。對照組中，男性17例，女性13例，年齡16～50歲，平均(32.29±4.64)歲；研究組中，男性18例，女性12例，年齡16～50歲，平均(31.50±4.81)歲。兩組的年齡、性別等基本資料未見有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。納入本研究的兩組患者均經過術前鼻內窺鏡檢查及鼻竇CT檢查確診，并排除伴有感染性疾病、凝血功能障礙或術前1個月曾服用抗生素、抗組胺藥物、糖皮質激素的患者。患者簽訂同意書后，在局麻或全麻下行鼻內窺鏡下鼻中隔偏曲矯正術，術后采集其部分下鼻甲黏膜組織作為實驗標本。

1.1.2 實驗材料 IL-16單克隆抗體(上海信裕生物科技有限公司)；兔抗人SP-D單克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；兔SP檢測試劑盒(SP-9001)免疫組化試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 將術中采集的下鼻甲黏膜組織選為實驗標本，用生理鹽水對其進行反復沖洗，隨后加入適量10%多聚甲醛溶液將標本固定24 h。固定完成后，用自來水將標本反復沖洗1 h，并分別加入濃度70%、85%、95%、100%酒精進行梯度脫水。同時，選用二甲苯為透明劑透明2次，每次透明30 min。然后，將透明后的標本進行浸蠟、包埋和切片，并貼附在載玻片上，置于60 ℃烤箱中進行烘烤2 h，取出并放置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 常規(guī)蘇木精-伊紅染色(HE染色) (1)取出備用標本用二甲苯脫蠟，反復進行2次，每次大約5～10 min；然后分別加入濃度為100%、95%、85%、75%的酒精浸潤10 min，再用蒸餾水反復沖洗2 min；(2)向標本中加入適量蘇木素進行染色，每次5～10 min；(3)用自來水沖洗3 min；(4)加入鹽酸乙醇分化液(1%)浸潤分化30 s；(5)用自來水沖洗5 min；(6)再用0.5%淡氨水浸潤處理30 s，并用自來水沖洗5 min；(7)將標本玻片加入到0.5%伊紅溶液中染色3 min；(8)用蒸餾水對其進行沖洗1 min；(9)分別加入濃度為95%、90%、80%、75%的酒精進行梯度脫水l0 min，并用二甲苯對其進行透明15 min。最后，用中性樹脂封片。

1.2.3 免疫組化(SP法) (1)脫蠟脫水：將備用的標本玻片放置到60 ℃的烤箱中進行烘烤30 min，并采用二甲苯脫蠟再進行梯度酒精脫水；(2)抗原修復：應用PBS緩沖液對將玻片反復洗滌3次，每次5 min，隨后加入抗原熱修復液進行10 min的加熱修復，冷卻，再用PBS沖洗3次，每次5 min；(3)血清封閉：在每個載玻片上加入50 μL的山羊血清工作液以對其進行封閉處理，并在常溫下加入內源性生物素封閉20 min，甩除勿洗；(4)分別滴加一抗(兔抗人SP-D單克隆抗體和IL-16單克隆抗體)，放置在4 ℃冰箱中。24 h后取出將其置于常溫環(huán)境中，用PBS液沖洗3次，每次耗時5 min；(5)滴加二抗：在每張載玻片上滴加50 μL二抗工作液，置于37 ℃中孵育30 min，并用PBS沖洗3次，每次約為5 min；(6)滴加三抗：在每張載玻片上滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，置于37 ℃中孵育30 min。用PBS沖洗3次，每次約5 min；(7)顯色：在載玻片上滴加適量的DAB顯色劑，使其在常溫下顯色，并在顯微鏡下調整其顯色情況，直至顯色適度為止，用自來水對其進行沖洗3 min以終止顯色反應；(8)復染：用蘇木素復染2～3 min，再用自來水沖洗終止。隨后采用1%鹽酸乙醇分化，再用自來水沖洗10 min；(9)封片：取適量二甲苯作脫蠟透明處理，并加入不同濃度的酒精作梯度脫水，最后再用中性樹膠作封片處理。與此同時，取適量PBS緩沖液代替一抗進行陰性對照。

1.2.4 結果判定 (1)HE染色結果判定：嗜酸性粒細胞的細胞核有藍色的單核或雙核，胞質中呈粉紅色，故可通過觀察細胞是否呈“紅質藍核”來判斷嗜酸性粒細胞的浸潤狀況。每張玻片標本均在高倍鏡、低倍鏡中選取5個視野進行觀察，并選取典型圖片拍照。(2)免疫組化結果判定：SP-D和IL-16在免疫組化實驗中呈棕黃色顆粒，且可布滿陽性細胞。待觀察到棕黃色顆粒后，需在顯微鏡下觀察其在陽性細胞中的表達部位，并能夠隨機選取5個顯微視野應用Biosens Digital Imaging System(V1.6)圖像分析系統(tǒng)測量每張玻片中SP-D、IL-16陽性細胞的吸收度(A值)平均值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 蘇木精-伊紅染色結果

研究組標本中可見組織黏膜下有毛細血管擴張和腺體增生，尤以大量的嗜酸性粒細胞為主的炎性細胞浸潤為主要表現(圖1)。而對照組的標本中僅可見有少量的炎性細胞表達(圖2)。經比較發(fā)現，研究組中含有的嗜酸性粒細胞計數平均為(15.59±2.86)個/HP，較對照組的(1.93±0.46)個/HP要多，差異具有統(tǒng)計學意義(t=25.807，P=0.001)。

2.2 免疫組化結果

研究組中的SP-主要表達在標本組織的細胞質中，尤以黏膜下腺體細胞、纖毛上皮細胞以及炎性細胞的胞質最為顯著(圖3)，但在對照組中僅見有少量的SP-D表達，且多分布在細胞間質(圖4)。至于IL-6，其在研究組中主要分布于黏膜下腺分泌體細胞、鼻粘膜組織的纖毛上皮細胞、炎癥細胞的細胞質中(圖5)；而在對照組中極少見有IL-6陽性表達，僅部分散在性地分布在細胞間質中(圖6)。經計算發(fā)現，研究組鼻粘膜組織中的SP-D、IL-16陽性表達均顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。此外，經Person相關性分析發(fā)現，研究組患者中血清SP-D、IL-16水平呈正相關(r=0.715，P=0.001)。

表1 SP-D、IL-6在兩組標本組織中的陽性表達比較

3 討論

慢性鼻炎就是鼻粘膜及粘膜下層的一種慢性炎癥，主要由鼻竇黏膜上皮細胞及T細胞介導，通過細胞因子、趨化因子及炎性介質對促炎細胞進行激活，進而導致腺體增生、炎癥細胞浸潤、黏蛋白分泌異常、組織重塑等病理改變[4]。有研究[5-6]指出，細胞趨化因子可使相關未成熟的炎癥細胞分化為成熟細胞，并促使其遷移和聚集到鼻粘膜上釋放大量的炎性介質，其中，嗜酸性粒細胞是炎性介質的主要釋放來源。與此同時，多種炎性細胞浸潤在鼻粘膜就會導致慢性炎癥，而慢性炎癥的發(fā)生又可導致鼻粘膜組織重塑，進而使炎癥加重，此為持續(xù)性慢性鼻炎遷延不愈的主要原因。

相關文獻[7]也報道，在持續(xù)性慢性鼻炎發(fā)病過程中Th2輔助細胞能夠調節(jié)中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等炎癥細胞的活性，使得炎性細胞大量浸潤在鼻粘膜中。本研究行常規(guī)蘇木精-伊紅染色實驗發(fā)現，研究組中含有的嗜酸性粒細胞計數(15.59±2.86)個/HP，較對照組的(1.93±0.46)個/HP顯著增多，提示持續(xù)性慢性鼻炎組織中有大量的嗜酸性粒細胞浸潤。Berrettini等[8]通過研究慢性鼻炎兒童的嗜酸性粒細胞的浸潤狀況，發(fā)現嗜酸性粒細胞的表達水平高低可成為臨床預測兒童慢性鼻炎病情發(fā)展的一項重要因素。現代藥理學研究也報道[9]，孟魯司特能夠通過減輕嗜酸性粒細胞的浸潤來改善慢性鼻炎患者的癥狀。由此可知，嗜酸性粒細胞在持續(xù)性慢性鼻炎發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。

SP-D是膠原凝集素家族中的一種蛋白質，主要由呼吸道表面的Clara細胞和肺泡細胞分泌，具有維持肺泡表面穩(wěn)定的作用，并可通過下調炎癥反應發(fā)揮一定的免疫調節(jié)作用。近年有研究[10]發(fā)現，除了肺臟，SP-D還可廣泛分布在鼻腔-鼻竇黏膜、咽鼓管黏膜、胸膜、腸系膜等部位。Schicht等[11]研究發(fā)現，人類下鼻甲黏膜中存有表面活性蛋白的前提形式—板層體，其在維持鼻部正常生理功能中起著重要的作用。Lin等[12]的研究也顯示，在慢性鼻竇炎患者的鼻粘膜組織中含有大量的板層小體，其可調節(jié)鼻腔鼻竇中分泌物的粘滯度。IL-16屬于一種T細胞趨化劑，同時也是一種前炎癥細胞因子，由多種炎性細胞合成分泌的具有典型的調節(jié)免疫和介導炎癥等作用。

本研究結果顯示，研究組鼻粘膜組織中含有的SP-D、IL-16陽性表達水平較對照組顯著升高，且在鼻中隔偏曲伴持續(xù)性慢性鼻炎患者中血清SP-D、IL-16水平呈正相關，筆者分析其原因，可能是鼻腔為呼吸道的起始段，最先接觸到外界空氣中的顆粒病原體等物質，可刺激鼻腔黏膜表面的SP-D大量分泌，同時通過趨化活化嗜酸性粒細胞促使多種促炎因子積聚參與到炎癥反應過程，使得鼻腔-鼻竇黏膜的血管通透性顯著升高，黏膜組織結構水腫。而IL-16作為一種T淋巴細胞趨化劑和前炎性細胞因子，在持續(xù)性慢性鼻炎發(fā)病過程中能夠激活CD4+T細胞是IL-5、IL-4等炎癥細胞因子釋放，進而加重鼻腔黏膜炎癥反應的程度，促使慢性鼻炎發(fā)展。因此，本研究可認為，SP-D和IL-16是持續(xù)性慢性鼻炎病變中重要的嗜酸性粒細胞趨化因子，且可增強嗜酸性粒細胞的局部作用，共同參與持續(xù)性慢性鼻炎的病變過程。

綜上所述，趨化因子IL-16與SP-D在持續(xù)性慢性鼻炎組織中呈高表達，其可能是通過動員并聚集大量促炎因子使機體維持非可控的炎癥環(huán)境，故在持續(xù)性慢性鼻炎發(fā)病機制中可能發(fā)揮了重要的作用。