精氨酸加壓素聯(lián)合丹參素對(duì)骨質(zhì)疏松患者成骨細(xì)胞凋亡及增殖的影響

曹子君，王亞蘭，陳妮妮，郝定均，李青梅，胡靖，張正平，董亮

(1.西北工業(yè)大學(xué)保健室，陜西 西安 710072；2.西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院，陜西 西安 710054)

骨質(zhì)疏松是一類以骨密度降低為典型癥狀的疾病，臨床主要為腰背疼痛、椎體變形、骨骼疼痛等，發(fā)病的主要機(jī)理為骨質(zhì)減少，使骨的微結(jié)構(gòu)遭到破壞，進(jìn)而引發(fā)骨質(zhì)脆性增加、彈性下降。臨床研究[1-3]認(rèn)為，該病的發(fā)生與飲食結(jié)構(gòu)、生活方式、激素水平等密切相關(guān)，且隨著患者年齡的增長，發(fā)病率會(huì)大幅提升。骨質(zhì)疏松不僅會(huì)引發(fā)患者疼痛、體型改變，還會(huì)大大增加骨折發(fā)生的幾率，嚴(yán)重影響患者的日常生活。精氨酸加壓素也稱為血管加壓素、抗利尿激素，是由下丘腦產(chǎn)生并儲(chǔ)存于神經(jīng)垂體的一類激素，在調(diào)節(jié)顱內(nèi)壓和腦組織代謝中發(fā)揮重要生理作用。丹參素是丹參水溶成分中的主要藥效成分之一，具有抗氧化、提高機(jī)體免疫力等作用[4-5]。本研究擬通過精氨酸加壓素聯(lián)合丹參素對(duì)骨質(zhì)疏松患者成骨細(xì)胞凋亡和增殖的影響觀察，為臨床干預(yù)治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇1例來自西北工業(yè)大學(xué)保健室接受髖關(guān)節(jié)手術(shù)治療的骨質(zhì)疏松患者的骨組織為研究材料。患者為男性，59歲，因摔傷導(dǎo)致骨折，無其他合并癥。患者簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 成骨細(xì)胞培養(yǎng) 將取出的骨塊使用生理鹽水沖洗，而后轉(zhuǎn)入無菌試管中置入細(xì)胞培養(yǎng)室中，使用骨塊培養(yǎng)成骨細(xì)胞，具體步驟如下：(1)使用含有100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的平衡鹽溶液沖洗骨組織；(2)將骨組織置入一無菌培養(yǎng)皿中，切骨小梁置入另一無菌培養(yǎng)皿；(3)加入D-hanks溶液浸泡骨小梁，去除骨組織上殘留的脂肪及血液；(4)使用完全培養(yǎng)液調(diào)制細(xì)胞培養(yǎng)液；(5)將骨小梁切為碎塊后置入細(xì)胞培養(yǎng)液中，使用骨組織接種環(huán)將骨小梁鋪散于瓶底，37 ℃條件下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長滿瓶底后，去除骨組織塊，使用胰蛋白酶消化離心法提取成骨細(xì)胞。

1.2.2 分組干預(yù) 將成骨細(xì)胞使用胰蛋白酶適當(dāng)消化后，將細(xì)胞吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，以1×104/L的濃度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，均分為A、B、C、D四組。A組細(xì)胞使用生理鹽水實(shí)施干預(yù)，B組細(xì)胞加入100 nmol/L的精氨酸加壓素實(shí)施干預(yù)，C組細(xì)胞加入20 μg/mL丹參素實(shí)施干預(yù)，D組細(xì)胞加入100 nmol/L的精氨酸加壓素+20 μg/mL丹參素實(shí)施干預(yù)，4組細(xì)胞均干預(yù)3 d。

1.2.3 觀察指標(biāo) (1)細(xì)胞凋亡的評(píng)估：在培養(yǎng)孔中加入20 μL質(zhì)量濃度為5.0 g/L的MTT溶液，于37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，而后吸去培養(yǎng)液中的上層清液，在培養(yǎng)孔中加入150 μL的DMSO，放置于水平振蕩器上震蕩10 min后使用甲臜充分溶解，而后于酶聯(lián)免疫檢測儀上設(shè)置490 nm波長條件下檢測培養(yǎng)孔吸光度，進(jìn)而推測細(xì)胞凋亡情況。(2)凋亡蛋白表達(dá)檢測：檢測4組細(xì)胞干預(yù)3 d后凋亡蛋白Bax、AIF、cyto-C蛋白的表達(dá)情況，并進(jìn)行對(duì)比分析。(3)成骨細(xì)胞增殖計(jì)算：取生長良好的成骨細(xì)胞使用胰酶消化后，使用體積分?jǐn)?shù)為1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基和體積分?jǐn)?shù)為12%的胎牛血清重懸細(xì)胞，并接種于6孔板中，24 h后，按分組條件實(shí)施干預(yù)，3 d后收集細(xì)胞，并取上層清液檢測堿性磷酸酶，于450 nm波長處檢測吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡情況比較

干預(yù)3 d后，4組成骨細(xì)胞凋亡情況為D組最小，B和C組相近，A組最大。除B組和C組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P>0.05)，其余各組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞凋亡情況比較

*P<0.05，與B組、C組、D組相比，#P<0.05，與D組相比。

2.2 各組凋亡蛋白表達(dá)情況比較

細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、AIF、cyto-C蛋白表達(dá)情況為D組最小，B和C組次之，A組最大。其中，D組明顯低于B組和C組(P<0.05)，B組和C組明顯低于A組(P<0.05)，B組和C組組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組凋亡蛋白表達(dá)情況比較(x±s)

*P<0.05，與B組和C組相比；#P<0.05，與A組相比。

2.3 各組成骨細(xì)胞增殖及BMP-2增殖蛋白表達(dá)情況比較

4組細(xì)胞增殖情況及BMP-2增殖蛋白表達(dá)為D組最大，B和C組次之，A組最小。其中，D組高于B和C組(P<0.05)，B和C組高于A組(P<0.05)，B和C組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組成骨細(xì)胞增殖情況比較

*P<0.05，與B組和C組相比；#P<0.05，與A組相比。

3 討論

骨質(zhì)疏松是以骨骼重量減輕、骨骼微結(jié)構(gòu)發(fā)生損壞致骨彈性降低的一類骨骼疾病，容易發(fā)生疼痛、骨折等臨床現(xiàn)象。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[6]顯示，現(xiàn)階段我國約有9千萬骨質(zhì)疏松患者，且該數(shù)字隨著社會(huì)老齡化趨勢的上升而逐年提升。骨質(zhì)疏松不但會(huì)降低患者的骨密度，誘發(fā)疼痛、體態(tài)變化等現(xiàn)象，也會(huì)影響患者的生活質(zhì)量，降低患者的自主生活能力。因此，如何通過治療提高骨質(zhì)疏松患者的骨密度是現(xiàn)階段醫(yī)務(wù)工作者研究的重點(diǎn)?，F(xiàn)有臨床研究[7]顯示，骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)理主要與患者的激素水平、營養(yǎng)狀況、遺傳因素等有關(guān)。王亞春等[8]的研究指出，相比于絕經(jīng)前健康婦女，絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松婦女其雌激素水平會(huì)出現(xiàn)顯著下降，同時(shí)骨標(biāo)志物β-膠原降解產(chǎn)物水平也會(huì)出現(xiàn)顯著變化，提示激素在骨質(zhì)疏松的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。華關(guān)民等[9]的研究也指出，不同性別不同年齡個(gè)體骨質(zhì)疏松及血清骨標(biāo)志物水平存在明顯的差異。

成骨細(xì)胞是由內(nèi)外骨膜和骨髓中基質(zhì)內(nèi)的間充質(zhì)始祖細(xì)胞分化而來的，能夠分泌多種生物活性物質(zhì)，對(duì)骨形成和重建過程產(chǎn)生較大影響的一類細(xì)胞，是骨形成的主要功能細(xì)胞，在骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化過程中可發(fā)揮較大作用，其與破骨細(xì)胞的平衡是維持機(jī)體正常骨量的關(guān)鍵，一旦平衡被打破，則易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松等病理性改變。楊越華[10]的研究指出，氧化應(yīng)激反應(yīng)與骨質(zhì)疏松形成具有密切聯(lián)系，成骨細(xì)胞在過氧化狀態(tài)下凋亡會(huì)明顯增加，破壞成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的平衡狀態(tài)，進(jìn)而誘發(fā)骨質(zhì)疏松出現(xiàn)。另有研究指出，通過對(duì)去勢大鼠破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞平衡的調(diào)節(jié)，能夠顯著緩解大鼠骨質(zhì)疏松癥狀，提高其骨密度。以上研究均提示，對(duì)成骨細(xì)胞凋亡及增殖的干預(yù)就治療骨質(zhì)疏松具有重要意義。

本研究通過體外培養(yǎng)骨質(zhì)疏松患者成骨細(xì)胞并分組實(shí)施干預(yù)的方式，就精氨酸加壓素聯(lián)合丹參素對(duì)骨質(zhì)疏松患者成骨細(xì)胞凋亡及增殖的影響進(jìn)行了探究，結(jié)果顯示，相比于使用生理鹽水進(jìn)行干預(yù)的A組細(xì)胞，使用精氨酸加壓素干預(yù)的B組及使用丹參素進(jìn)行干預(yù)的C組細(xì)胞治療后其凋亡情況明顯較小，同時(shí)B、C兩組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、AIF、cyto-C表達(dá)情況也較A組明顯降低。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)分析，骨質(zhì)疏松的出現(xiàn)與個(gè)體激素水平有緊密的聯(lián)系，而合成精氨酸加壓素的垂體在激素分泌、保存中具有重要作用，垂體功能減退會(huì)導(dǎo)致個(gè)體骨量丟失，進(jìn)而誘發(fā)骨質(zhì)疏松。吳慶田等[11]通過將小鼠成骨細(xì)胞進(jìn)行分組干預(yù)發(fā)現(xiàn)，加用精氨酸加壓素的小鼠成骨細(xì)胞其細(xì)胞內(nèi)cAMP水平會(huì)明顯上升，而cAMP能夠通過活化蛋白激酶A進(jìn)而引發(fā)一系列生物學(xué)反應(yīng)，如細(xì)胞增殖分化等，對(duì)成骨細(xì)胞的凋亡及增殖產(chǎn)生影響。丹參素具有顯著的抗氧化作用，臨床應(yīng)用證實(shí)在治療骨質(zhì)疏松中具有較好的效果。王秉義等[12]通過將60只大鼠進(jìn)行分組干預(yù)的方式發(fā)現(xiàn)，丹參素具有拮抗醋酸潑尼松龍誘導(dǎo)氧化應(yīng)激所致骨質(zhì)疏松大鼠中成骨細(xì)胞凋亡的作用，其機(jī)理為通過活化PI3k/Akt通路從而減少成骨細(xì)胞的凋亡。此外，丹參素中含有多個(gè)酚經(jīng)基，能夠提供活性氧進(jìn)而阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低過氧化對(duì)成骨細(xì)胞造成的損傷。本研究結(jié)果還顯示，精氨酸加壓素聯(lián)合丹參素能夠更有效的抑制骨質(zhì)疏松患者成骨細(xì)胞的凋亡，加快成骨細(xì)胞的增殖，分析其原因可能為兩種藥物合用能夠從不同方面對(duì)成骨細(xì)胞產(chǎn)生影響，進(jìn)而加快了成骨細(xì)胞的增殖。

綜上所述，精氨酸加壓素聯(lián)合丹參素能夠有效抑制骨質(zhì)疏松患者成骨細(xì)胞凋亡，同時(shí)還可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，且效果優(yōu)于單獨(dú)干預(yù)，是臨床值得推廣的一種干預(yù)治療方案。