半枝蓮總黃酮對非小細胞肺癌細胞增殖及遷移的影響

任守雷，郭曉曉，陳翠翠，趙海燕，李來慶

半枝蓮（Scutellɑriɑ bɑrbɑtɑ D.Don，SB）屬于唇形科植物，性味辛、苦、寒，歸肺、肝、腎經，是中醫處方和成藥中的常用中藥，其主要有散瘀止痛、涼血解毒、清熱利濕和消腫之功效；主要有效成分為黃酮類、生物堿、鞣質和甾體類等化合物，具有抗腫瘤作用，可誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖及遷移，改善腫瘤細胞耐藥性［1-3］。針對其作用機制的研究表明，半枝蓮提取物可通過抑制PI3K和TGF-β信號通路抑制癌細胞遷移和侵襲［4-5］；也可通過下調Treg細胞控制Th1/Th17型免疫反應，抑制腫瘤的生長［6］。

肺癌是常見惡性腫瘤之一，致死率較高，其中非小細胞肺癌是肺癌的主要發病類型，約占肺癌發病率的80%，非小細胞肺癌主要包括鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌3種類型［7-9］。人肺腺癌A549細胞常用于肺癌模型制備，本研究于2017年10月至2018年2月通過觀察半枝蓮總黃酮提取物對A549細胞增殖、凋亡及遷移的影響，探討半枝蓮總黃酮對于肺癌治療方面的機制，為半枝蓮總黃酮在肺癌方面的治療提供參考。

圖1 半枝蓮總黃酮誘導人肺腺癌A549細胞凋亡情況：A、B分別為陰性、陽性對照組；C、D、E、F、G分別為實驗組1，5，10，20，40 μg/mL

1 材料與方法

1.1材料與儀器胎牛血清和DMEM培養基購自美國Gibco公司；半枝蓮，購自太極集團四川綿陽制藥有限公司；蘆丁對照品，購自中國藥品生物制品鑒定所；四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測試劑盒，購自上海碧云天生物技術公司；抗凋亡抑制蛋白Survivin抗體、抗促凋亡蛋白酶Caspase-3抗體購自英國Abcam公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記山羊抗兔IgG購自博士德公司；細胞培養6孔板購自美國Corning公司；磷脂結合蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexinv-FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自中國凱基公司；粵顯1400602型倒置顯微鏡；二氧化碳恒溫培養箱（MCO175，SANYO）；多管架自動平衡離心機（盧湘儀，TDZ5-WS，上海）；多功能酶標儀（PerkinElmer公司，EnSpire，美國）；流式細胞檢測儀（Millipore公司，Guava easyCyte?8HT，美國）。

1.2方法

1.2.1半枝蓮總黃酮提取液制備 稱取適量半枝蓮，甲醇溶解，制取總黃酮粗提液；取定量蘆丁溶于甲醇，制備對照品。依次配置蘆丁對照品，濃度分別為0.24 mg/mL、0.48 mg/mL、0.72 mg/mL、0.96 mg/mL、1.2 mg/mL，以甲醇為空白對照，測定500 nm下樣品吸光度，測定半枝蓮總黃酮粗提取液濃度［12］。1.2.2半枝蓮總黃酮處理A549細胞 將A549細胞培養至對數生長期，計數，鋪96孔板，每孔鋪板3×103個/100 μL，5%二氧化碳，37℃恒溫培養24 h。調整半枝蓮總黃酮溶液濃度為1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL，每孔加200 μL，作為實驗組。陰性對照組加200 μL1640培養液，陽性對照組加入200 μL 40 μg/mL蘆丁溶液。每組做5個復孔。

A549細胞鋪板，5%二氧化碳，37℃恒溫培養24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，繼續培養4 h，去除培養液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，震蕩溶解藍色結晶物。酶標儀檢測490 nm光吸收值（OD值），按照以下公式計算增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/陰性對照組OD值）×100%。

1.2.3流式細胞術 將A549細胞培養至對數生長期，計數，調整細胞密度為5×105個/毫升，每孔2 mL，鋪板6孔板，每個濃度做3個復孔，其他處理方式同1.2.2。5%二氧化碳，37℃恒溫培養24 h。棄培養基，PBS緩沖液洗滌，胰酶消化，終止消化后，1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞，PBS緩沖液重懸計數；取1×105個細胞，1 000 r/min離心5 min收集細胞，棄上清，100 μL 1×Annexin V buffer重懸，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色液，混勻。室溫避光孵育15 min。流式細胞儀上機檢測（Annexin V-FITC綠色熒光，PI紅色熒光）。

1.2.4蛋白質印跡法（Western Blot）檢測Survivin，Caspase-3蛋白的表達 將A549細胞培養至對數生長期，計數，調整細胞密度為5×105個/毫升，每孔2 mL，鋪板6孔板，每個濃度做3個復孔，其他處理方式同1.2.2。5%二氧化碳，37℃恒溫培養24 h。消化收集細胞，裂解，12 000 r/min離心5 min，取上清，BCA定量；加入5×十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液，100℃沸水浴5 min。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），上樣量為20 μg。濃縮膠60 V，20 min；分離膠120 V，60 min電泳。100 V，60 min轉膜；5%牛血清白蛋白（BSA）封閉60 min，一抗4℃孵育過夜，洗膜；二抗室溫孵育1 h，洗膜；ECL發光液室溫孵育5 min，于暗室醫用X光底片曝光1 min后，依次顯影、定影。

1.2.5細胞遷移 將A549細胞培養至對數生長期，計數，調整細胞密度為5×105個/mL，每孔2 mL，鋪板6孔板，每個濃度做3個復孔，37℃，5%二氧化碳恒溫培養24 h至細胞基本鋪滿板孔。用槍頭在板孔內做垂直劃痕，PBS緩沖液洗滌，加入終濃度為1，5，10，20，40 μg/mL的半枝蓮總黃酮1640培養液培養24 h，倒置相差顯微鏡觀察。每個視野內，抽簽法選擇3個區域，并計算100×視野內遷移劃痕空隙的像素。

1.3統計學方法實驗數據采用±s表示，使用SPSS 19.0軟件進行分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1MTT檢測人肺腺癌A549細胞增殖情況經不同處理后，陽性對照組增殖抑制率為（57.234±0.533）%，實驗組1，5，10，20，40 μg/mL半枝蓮總黃酮處理增殖抑制率分別為（14.852±1.059）%、（23.486±1.366）%、（36.396±0.321）% 、（46.179±1.334）%和（51.530±1.054）%。半枝蓮總黃酮抑制人肺腺癌A549細胞增殖，隨濃度增加抑制率顯著升高，呈濃度依賴（F=1 408.303，P＜0.001）。推測半枝蓮總黃酮可抑制肺癌細胞A549的增殖，且其抑制作用強弱與半枝蓮總黃酮濃度有關。

2.2流式細胞術檢測人肺腺癌A549細胞凋亡情況流式細胞術分析各組細胞凋亡情況，陰性對照組凋亡率為（9.09±0.50）%；實驗組1，5，10，20，40 μg/mL半枝蓮總黃酮處理凋亡率分別為（24.62±0.70）%、（34.67±0.46）%、（46.92±0.29）%、（55.67±0.57）%和（59.29±0.73）%；陽性對照組凋亡率為（67.27±1.48）%。與陰性對照組比較，實驗組凋亡率增加（F=1 467.681，均P＜0.001）。隨半枝蓮總黃酮濃度增加凋亡率顯著增加，結果顯示，半枝蓮總黃酮誘導人肺腺癌A549細胞凋亡。見圖1。

2.3Western Blot檢測Caspase-3、Survivin蛋白表達情況與陰性對照組（0.44±0.05）和陽性對照組（1.56±0.24）相比，半枝蓮總黃酮處理人肺腺癌A549細胞，Caspase-3凋亡蛋白表達逐漸升高［分別為（0.75±0.08，（0.87±0.03），（0.90±0.07），（0.98±0.06）和（1.23±0.07）］（F=34.176，P＜0.001）。與陰性對照組（1.46±0.06）和陽性對照組（0.45±0.06）相比，Survivin凋亡抑制蛋白表達逐漸下降［分別為（1.21±0.12），（0.86±0.06），（0.80±0.06），（0.71±0.09）和（0.54±0.10）］（F=57.730，P＜0.001）。半枝蓮總黃酮通過上調Caspase-3表達和下調Survivin表達，誘導人肺腺癌A549細胞凋亡。見圖2。

圖2 半枝蓮總黃酮處理人肺腺癌A549細胞凋亡蛋白的表達

2.4劃痕實驗檢測A549細胞遷移情況細胞劃痕實驗中，與陰性對照組（707.6±92.6）像素和陽性對照組（209.6±41.7）像素相比，不同濃度半枝蓮總黃酮處理組細胞遷移情況明顯不同［分別為（594.0±26.7）像素，（410.0±44.0）像素，（359.3±38.8）像素，（307.0±54.3）像素和（285.3±44.0）像素］（F=34.612，P＜0.001）。半枝蓮總黃酮濃度升高可導致細胞遷移速度降低，推測半枝蓮總黃酮能夠抑制人肺腺癌A549細胞遷移，并呈劑量依賴性。見圖3。

3 討論

半枝蓮又稱并頭草、金挖耳、牙刷草、狹葉韓信草。最早記載于《外科正宗》一書，具化瘀、清熱、解毒等功效，臨床上應用具有抑菌、抗病毒、解熱、保肝、抗腫瘤、抗癌等作用，被現代中藥醫師青睞。近年來，臨床研究者對半枝蓮藥效、化學成分等的研究大幅度增多，為其在臨床應用提供極大幫助。有研究證實，植物提取物中的某些黃酮類和生物堿類化合物具有明顯的抗腫瘤作用，作用的機制是在一定程度上誘導腫瘤細胞凋亡、遷移以及侵襲［4］。本研究的MTT實驗表明，不同濃度的半枝蓮總黃酮對人肺腺癌A549細胞具有不同程度的抑制，且這種抑制作用隨藥物濃度的增加而增強，顯示出一定的劑量依賴性。流式細胞儀檢測結果表明，不同濃度的半枝蓮提取物可誘導人肺腺癌A549細胞出現不同程度的凋亡，且細胞凋亡率隨藥物濃度的增加而提高，這提示半枝蓮總黃酮抑制A549細胞增殖的機制在于誘導A549細胞凋亡。

圖3 半枝蓮總黃酮對人肺腺癌A549細胞遷移的影響：A、B分別為陰性、陽性對照組；C、D、E、F、G分別為實驗組1，5，10，20，40 μg/mL

Survivin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis protein，IAP）的新成員，參與促進細胞周期調控、細胞有絲分裂和血管生成等。Survivin具有腫瘤特異性，抵抗細胞凋亡在腫瘤發生、發展過程中發揮著重要作用［10］。Gu等［11］研究發現紫杉醇可下調Survivin的表達誘導細胞凋亡Hela細胞凋亡，同時減緩其增殖速率；Survivin的兩個結構域BIR和C螺旋可精確調節細胞有絲分裂、細胞凋亡以及自噬，可作為腫瘤靶向藥物研發對象，提高靶向藥物的準確性及有效性［12］；在83%的子宮內膜癌中，Survivin表達量上調，細胞耐藥性增強［13］；靶向干擾食管癌Eca-109細胞中Survivin基因表達，可曾慶人食管癌Eca-109細胞對氟尿嘧啶的化療敏感性，利于提高化療療效［14］；儲進錦等通過紫外照射人膠質瘤U251細胞，發現經輻射可誘導膠質瘤細胞COX-2和Survivin蛋白表達量增加，這可能是膠質瘤存在放射抵抗的機制之一［15］。Caspase-3在細胞凋亡中起著不可替代的作用，可以被多種因素活化，既可被factor associated suicide/factor associated suicide ligand（Fas/FasL，自殺相關因子及其配體）途徑活化，也可以通過顆粒酶B途徑活化，活化后的Caspase-3可促進細胞凋亡。研究表明，Survivin表達量與Caspase-3表達量具有負相關性，推測Survivin通過抑制Caspase-3表達抑制細胞凋亡［2，16］。

本研究蛋白質印跡法檢測結果表明半枝蓮總黃酮可下調Survivin蛋白的表達水平和上調Caspase-3蛋白的表達水平，且其調控具有劑量依賴性。因而，半枝蓮總黃酮通過下調A549細胞的Survivin蛋白表達，減弱Survivin對細胞凋亡因子Caspase-3活性抑制作用，誘導A549細胞凋亡，最終抑制A549細胞的增殖。

腫瘤細胞的侵襲轉移是惡性腫瘤的主要生物學特性之一，是腫瘤病人死亡的主要原因，亦是腫瘤切除預后不良的原因［17］。據統計，臨床腫瘤病人約有80%～90%死于腫瘤細胞的侵襲和轉移［18］。本研究通過劃痕實驗結果提示，半枝蓮總黃酮可抑制人肺腺癌A549細胞的遷移，且其作用隨藥物濃度增加而增強，呈一定的劑量依賴性。

綜上所述，半枝蓮總黃酮可抑制人肺腺癌A549細胞的增殖，可能與Survivin蛋白降低或caspase 3蛋白表達量升高有關；另外，半枝蓮總黃酮可抑制人肺腺癌A549細胞的遷移。

（本文圖1見插圖10-2）