椎管內阻滯對子癇前期孕鼠內皮細胞糖萼及分娩結局的影響

孫 申 黃紹強 田復波 袁紅斌

(1海軍軍醫大學附屬長征醫院麻醉科 上海 200003; 2復旦大學附屬婦產科醫院麻醉科 上海 200090)

子癇前期孕婦往往伴隨嚴重的全身炎癥反應[1],炎癥反應也是孕婦發生一系列病理生理改變的重要原因之一。內皮細胞糖萼(glycocalyx)是血管內皮細胞頂膜的薄分子層,也是一種圍術期生物標志物,可以調節血管通透性、介導剪切力反應、維持血管功能穩態,也可用于評價患者圍術期的循環狀況及預后。糖萼的破壞與機體的炎癥反應、凝血功能異常、缺血再灌注等有關,會進一步加重機體的炎癥瀑布反應和凝血功能障礙,從而形成惡性循環[2]。糖萼的破壞可以通過血液中糖萼組成成分黏結蛋白聚糖-1(syndecan-1)和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)的水平變化來判斷。炎性介質表達上調可能會導致子癇前期孕婦血液中的syndecan-1水平較普通孕婦或非孕婦女明顯增加[3-4]。

研究證實增強迷走神經活性的膽堿能抗炎通路可能會減緩子癇前期的進展,而胸段硬膜外阻滯可以通過膽堿能抗炎通路抑制全身炎癥反應[5-6],但椎管內阻滯對子癇前期孕婦的炎癥反應和糖萼的影響尚不清楚。本研究擬探討椎管內阻滯對子癇前期孕鼠的圍產期炎癥反應、內皮細胞糖萼脫落及分娩結局的影響。

材料和方法

交配及建模選擇8～12周齡SPF級SD雌性大鼠20只(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司)。將雌鼠與雄鼠按1:1的比例合籠,發現雌鼠陰栓記為妊娠第1天并編號,持續觀察腹部膨隆確定為妊娠。

大鼠妊娠第13天尾靜脈抽血3～5 mL[7],室溫下靜置30 min,1 000×g離心10 min,取上清,分裝,置于-80 ℃冰箱保存。使用ELISA法檢測血清中syndecan-1、HS、高遷移率族蛋白(high mobility group box-1,HMGB-1)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)水平,試劑盒型號分別為JL20972、JL47241、JL13892(上海江萊生物科技有限公司)和70-EK3822/2 (杭州聯科生物技術股份有限公司)。實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行,每個樣本設置3個重復孔,以減少操作誤差。測定450 nm處吸光度(D)值,繪制標準曲線,計算每個樣本的syndecan-1、HS、HMGB-1和TNF-α水平。

采用ALC-NIBP無創血壓測量分析系統(上海奧爾科特生物科技有限公司)測量收縮壓(systolic blood pressure,SBP),并采用LH750全自動血液分析儀(美國Beckman-Coulter公司)定量檢測24 h尿蛋白。將極低劑量內毒素(l.0 μg/kg,批號:E8029-1VL,西格瑪奧德里奇貿易有限公司)用生理鹽水稀釋至2 mL,在大鼠妊娠第14天使用微量注射泵由尾靜脈緩慢泵入,建立子癇前期孕鼠的動物模型[8-9]。

分組及處理將注射內毒素的孕鼠隨機分為2組(每組10只):生理鹽水組(N組)和鞘內置管組(I組)。第15天上午對所有孕鼠進行SBP和尿蛋白的檢測。第15天下午對N組孕鼠皮下注射200 μL生理鹽水,至妊娠第19天,每天下午1次,共5次;對I組孕鼠腹腔注射10%水合氯醛(100 mg/kg),麻醉后進行鞘內置管。將麻醉后的I組孕鼠取俯臥位,于背部正中線L4～5間隙處做一長約2 cm的皮膚縱切口,暴露L4～5棘突間隙并切除部分L4、L5棘突,形成V形切口后進一步暴露黃韌帶,用7號針頭穿破黃韌帶及硬脊膜,以鼠尾突然出現側擺或后腿抽動為成功標志。經硬脊膜破口向尾側插入大鼠鞘內專用導管(Rat Intrathecal Catheter,批號:0007741,上海玉研科學儀器有限公司),此時可見導管內充盈清亮的腦脊液[10-11]。蛛網膜下腔置管成功后,固定并縫扎導管,以防脫落。用0.9%生理鹽水10 μL沖洗導管,防止血栓堵塞。將導管埋于皮下,縫合切口。術畢肌注青霉素鈉,臺燈照射保溫1～2 h。待置管孕鼠清醒后,檢查活動情況,有肢體運動障礙的孕鼠被剔除出組。經鞘內導管注入0.75%布比卡因40 μL(批號:B5274,西格瑪奧德里奇貿易有限公司),并用10 μL生理鹽水沖洗導管[10,12-14]。鞘內給藥每8 h重復一次,直至仔鼠娩出。妊娠第16天和第19天,抽血并使用ELISA法檢測血清中syndecan-1、HS、HMGB-1和TNF-α水平。妊娠第19天同時測量SBP和24 h尿蛋白。妊娠第21天,對未自然分娩的大鼠行剖宮產,觀察并記錄仔鼠體質量和畸形的比例。

I組中1只孕鼠在鞘內注射布比卡因后死亡,其余19只孕鼠納入研究。孕鼠體質量的組間差異無統計學意義。

結 果

血清糖萼標志物水平的變化ELISA測定血清糖萼標志物水平,第13天syndecan-1和HS水平的組間差異無統計學意義(圖1A、1B)。第16 天和第19 天,N組syndecan-1水平顯著高于I組(P<0.001,P=0.001),N組的HS水平顯著高于I組(P<0.001,P=0.001)。兩組syndecan-1水平隨時間逐漸增加:N組,P<0.001,P=0.001和0.001;I組:P=0.015、0.001和0.001(圖1A)。第16 天和第19 天,N組HS水平差異無統計學意義,均顯著高于第13天(P=0.014和0.006),I組HS水平在各時間點的差異無統計學意義(圖1B)。這一結果提示血清糖萼標志物水平在組內和組間有顯著差異。

血清炎癥因子水平的變化ELISA測定血清炎癥因子水平,第13天HMGB-1和TNF-α水平的組間差異無統計學意義(圖1C、1D)。第16天和第19天N組HMGB-1水平顯著高于I組(P<0.001,P=0.001,圖1C),N組TNF-α水平顯著高于I組(P=0.025和0.006,圖1D)。第16天和第19天2組HMGB-1水平差異均無統計學意義,且均顯著高于第13 天(P<0.001,P=0.001;P<0.001,P=0.001)(圖1C)。第16天和第19天N組TNF-α水平顯著高于第13 天(P<0.001,P=0.001)(圖1D),I組的TNF-α水平在各時間點的差異均無統計學意義(圖1D)。這一結果提示血清炎癥因子水平在組內和組間有顯著差異。

SBP和24 h尿蛋白檢測第13天和第15天兩組間SBP水平差異無統計學意義(圖1E),第19天N組SBP水平顯著高于I組(P<0.001);第15天和第19天N組SBP水平顯著高于第13天(P<0.001,P=0.001),第15天和第19天N組SBP水平差異無統計學意義。第15天I組SBP水平顯著高于第13天和第19天(P<0.001,P=0.001),第13天和第19天N組SBP水平差異無統計學意義。各時間點組間尿蛋白水平差異均無統計學意義(圖1F)。第15天和第19天N組尿蛋白水平均顯著高于第13天(P=0.002,P=0.005),第15天和第19天N組尿蛋白水平差異無統計學意義。第15天I組尿蛋白水平均顯著高于第13天(P=0.003),第19天與第13天及第15天的尿蛋白水平差異均無統計學意義。這一結果提示SBP水平在組內和組間差異均有統計學意義,而24 h尿蛋白水平只在組內有顯著差異。

分娩結局N組順產率顯著低于I組(P=0.018,表1),2組剖宮產率和流產率差異均無統計學意義,N組異常仔鼠發生率顯著高于I組(P<0.001),N組仔鼠體質量顯著低于I組(P<0.001)。這一結果提示I組的分娩結局優于N組。

Group N:Normal saline group;Group I:Intrathecal tube group.(1)One samplettest,P<0.05,(2)Repeated measures one-way ANOVA,P<0.017.
圖1 子癇前期孕鼠的糖萼標志物、炎癥因子、SBP和24 h尿蛋白水平
Fig 1 The level of endothelial glycocalyx,inflammatory factors,SBP and proteinuria for 24 h in pregnant mice with preeclampsia

表1 兩組孕鼠的分娩結局Tab 1 The obstetric consequences in two groups

討 論

本研究發現子癇前期孕鼠的血清糖萼標志物syndecan-1水平隨產程進展逐漸升高,另一糖萼標志物HS水平在子癇前期高于非子癇前期,而椎管內阻滯可以減輕糖萼脫落,延緩血清糖萼水平的升高。子癇前期的炎癥因子HMGB-1、TNF-α及SBP、24 h尿蛋白水平均高于非子癇前期,椎管內阻滯可以減輕子癇前期孕鼠的HMGB-1、TNF-α和SBP水平的升高。椎管內阻滯組孕鼠的分娩結局優于對照組。本研究中子癇前期孕鼠和椎管內阻滯孕鼠兩個動物模型的建立借鑒了以往研究的經驗[8-14],SBP和24 h尿蛋白水平的變化證實兩個動物模型建模成功。

子癇前期的發病機制尚未完全明確,炎癥細胞、內皮細胞、凝血系統均參與子癇前期的病理生理過程,但各因素間的相互作用尚不清楚[2]。糖萼與這些因素均有關聯,有研究認為胎盤合體滋養層細胞syndecan-1表達減少可能是子癇前期的發病機制之一[15]。從以往研究和本研究的結果看,普通孕婦及子癇前期孕婦的炎癥因子與糖萼水平的變化存在一致性[3-4],但二者之間相互作用的具體機制尚不清楚。糖萼分子可能通過自身分子胞外段的蛋白聚糖和抗凝血酶Ⅲ結合,參與抗凝血的過程。子癇前期孕婦體內糖萼表達降低,與抗凝血酶Ⅲ分子的結合減少,激活的抗凝血酶Ⅲ減少,抗凝血作用減弱,凝血系統失衡,血液呈高凝狀態[15-16],導致子癇前期的發生。機體的炎癥反應、凝血功能異常都會導致糖萼的破壞,而糖萼的破壞又會進一步加重機體的炎癥瀑布反應和凝血功能障礙,從而形成惡性循環,最終可能影響孕婦的分娩結局。血管內皮細胞損傷是子癇前期的主要病理生理基礎,血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、胎盤來源生長因子(placental growth factor,PIGF)、可溶性VEGF受體1(sFlt-1)等是預測子癇前期的重要標記物[17]。而本研究關注的糖萼有可能成為將來預測子癇前期的新標志物[18]。糖萼在子癇前期發病機制中的作用值得深入研究。

研究證實交感神經系統的紊亂會加重糖萼的損傷[5,19],而阻斷交感神經會減少糖萼的脫落[20]。也有研究認為通過抑制交感神經活性,興奮膽堿能抗炎通路,可以延緩子癇前期進展[5,21-22]。椎管內阻滯同樣有抑制交感神經活性的作用,其減弱子癇前期產婦的糖萼損傷、炎癥反應及改善分娩結局的機制是否和膽堿能抗炎通路有關,有待于進一步研究。

本研究中椎管內阻滯降低子癇前期孕鼠的SBP水平,這與臨床上子癇前期產婦行椎管內分娩鎮痛后血壓下降是一致的,這證明椎管內阻滯有利于穩定子癇前期產婦的血流動力學,減少心腦血管意外。本研究中椎管內阻滯可以改善孕鼠的分娩結局,這可能與椎管內阻滯降低SBP、保護糖萼及抗炎作用有關。值得注意的是,本研究中的椎管內給藥方式、濃度和劑量與臨床上進行椎管內分娩鎮痛的方法有一定的差異。這是由于本研究的設計并不僅是為了模擬臨床上的椎管內分娩鎮痛,而是為了模擬子癇前期的產婦使用椎管內阻滯早期干預,留置導管后持續給藥,以期改善分娩結局。本研究的結果提示,臨床上對子癇前期產婦提前留置導管進行椎管內阻滯,除了緩解疼痛,還可改善內環境、降低血壓,進而改善分娩結局。

本研究發現椎管內阻滯可以減弱子癇前期孕鼠的糖萼脫落和炎癥反應,降低血壓并改善分娩結局。將來需進一步明確內皮細胞糖萼、炎癥反應與膽堿能抗炎通路在子癇前期發病中的作用及機制,從而更好地發揮椎管內阻滯對子癇前期的防治作用。